Ad-ING4對人胃癌AGS細胞凋亡及其p53基因表達的影響

程海燕 沈哲

Ad-ING4對人胃癌AGS細胞凋亡及其p53基因表達的影響

程海燕 沈哲

目的 探討腺病毒介導(dǎo)的腫瘤生長抑制因子4（Ad-ING4）在體外對人胃癌AGS細胞凋亡的作用及其p53基因表達的影響。方法 不同濃度（80、160、320ng/ml）的Ad-ING4作用人胃癌AGS細胞48h后，用AnnexinV-FITC檢測細胞凋亡率，RT-PCR檢測p53 mRNA的表達，免疫印跡法檢測p53蛋白表達水平，并與對照組進行比較。結(jié)果 凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度Ad-ING4可明顯誘導(dǎo)人胃癌AGS細胞凋亡，并呈濃度依賴性（P＜0.05）；Ad-ING4作用前AGS細胞p53 mRNA和p53蛋白表達水平較低，不同濃度Ad-ING4作用后p53 mRNA和p53蛋白表達水平明顯上調(diào)，呈濃度依賴性（P＜0.05）。結(jié)論 隨Ad-ING4作用濃度增高，人胃癌AGS細胞出現(xiàn)明顯凋亡，其機制可能與p53基因轉(zhuǎn)錄活性增強有關(guān)。

腺病毒介導(dǎo)的腫瘤生長抑制因子4 人胃癌AGS細胞 細胞凋亡 p53基因

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，可通過多種途徑侵襲、轉(zhuǎn)移，嚴重威脅人類生命。既往的治療僅限于手術(shù)及化療等手段，隨著對其發(fā)生機制的分子水平認識的提高，基因治療胃癌已成為目前胃癌治療研究的熱點。腫瘤生長抑制因子4（inhibitor of growth family member 4，ING4）是一種重要的抑癌基因，有研究已證明其在胃癌中表達明顯下降[1]。用腺病毒介導(dǎo)的ING4（Ad-ING4）感染多種腫瘤細胞，如膀胱癌T24細胞[2]、非小細胞性肺癌細胞[3]等，發(fā)現(xiàn)其可促進細胞凋亡。本研究主要檢測不同濃度的Ad-ING4在體外對人胃癌AGS細胞凋亡的作用及其p53基因表達的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑 人胃癌AGS細胞、Ad-ING4均由蘇州大學(xué)細胞與分子生物學(xué)教研室惠贈。RPMI1640培養(yǎng)基、噻唑鹽（MTT）和AnnexinV-FITC細胞凋亡試劑盒均購自杭州都泰生物科技有限公司。六隨機引物、p53和β-actin引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成。ING4一抗購自北京華夏遠洋科技有限公司，二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人胃癌AGS細胞，在條件為5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)，以2×105/ml的濃度傳代、接種，實驗分為對照組、Ad-ING4 80ng/ml、Ad-ING4 160ng/ml和Ad-ING4 320ng/ml 4組，不同濃度藥物作用48h后進行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.2 流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC細胞凋亡情況 乙二胺四乙酸消化后收集Ad-ING4處理48h后的細胞，2 000r/min離心4min，磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，先加入500μl Binding Buffer，再加入10μl AnnexinV-FITC，混勻，最后加入10μl水溶性染色劑PI，再混勻，避光、室溫、反應(yīng)15min，上流式細胞儀進行檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測p53 mRNA的表達 用Trizol一步法提取各組處理48h后細胞總RNA。4μg無DNA的總RNA逆轉(zhuǎn)錄（mRNA至cDNA），在25μl反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)。本體系包括dNTPs（10mM）0.5μl，MgCl2（25mM）2.0μl，cDNA 2μl，Taq酶（5U/μl）0.2μl，β-actin及p53 mRNA的上、下游引物（由primer 5軟件設(shè)計，南京金斯瑞生物科技公司合成）各0.5μl。擴增基因的引物序列：β-actin上游引物序列為 5′-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3′，下游引物序列為5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，擴增片段183bp。p53 mRNA上游引物序列為5′-ATATGAGCATCGAGCTCCCTCT-3′，下游引物序列為5′-CACAACTGCACAGGGCATGT-3′，擴增片段411bp。PCR擴增的條件均為94℃預(yù)變性5min，繼而95℃變性20s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環(huán)，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物在含10mg/ml，2.5μl溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，然后用凝膠成像分析儀攝像分析。最后用UVISOFT軟件處理數(shù)據(jù)，將目的條帶與內(nèi)參條帶的平均灰度值之比作為目的基因表達的相對含量。

1.2.4 免疫印跡法檢測p53蛋白的表達 Ad-ING4各實驗組取5×105個干預(yù)后的細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，取40μg總蛋白制樣，經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜，用TBST緩沖液配制的5%脫脂奶粉進行封閉，再與1∶1 000稀釋的一抗37℃搖床孵育1h以上，再與1∶10 000稀釋的二抗室溫孵育3h，將膜放入盛有TBST的平皿中進行洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑溫浴20min后曝光、顯影和定影，對結(jié)果進行吸光度掃描分析（明基5000掃描儀），與對照組結(jié)果進行對比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Ad-ING4各實驗組和對照組細胞凋亡率的比較 Ad-ING4干預(yù)人胃癌AGS細胞48h后，細胞凋亡率分別為對照組（6.8±0.32）%，Ad-ING4 80ng/ml組（12.5±0.56）%，Ad-ING4 160ng/ml組（22.7±1.42）%，Ad-ING4 320ng/ml組（35.6±2.51）%。隨著Ad-ING4濃度的升高，細胞凋亡率也明顯升高（P＜0.05）。Ad-ING4各實驗組的凋亡率和對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度Ad-ING4干預(yù)人胃癌AGS細胞48h的流式細胞圖

2.2 Ad-ING4對人胃癌AGS細胞p53 mRNA表達的影響 經(jīng)Ad-ING4作用48h后，p53 mRNA表達強度分別為對照組0.30±0.18、Ad-ING4 80ng/ml組0.44±0.12、Ad-ING4 160ng/ml組0.53±0.13、Ad-ING4 320ng/ml組0.68±0.15。隨著Ad-ING4濃度的升高，p53 mRNA表達也明顯增強（P＜0.05）。Ad-ING4各實驗組的p53 mRNA表達強度與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 Ad-ING4對人胃癌AGS細胞p53 mRNA表達的影響

2.3 Ad-ING4對人胃癌AGS細胞p53蛋白表達的影響 實驗組p53蛋白與β-actin相對灰度值比分別為0.30±0.03、0.44±0.05、0.58±0.06，均明顯高于對照組的0.21±0.01（均P＜0.05），見圖3。

圖3 Ad-ING4對人胃癌AGS細胞p53蛋白表達的影響

3 討論

ING4是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，它位于染色體12p13.31，包含了8個外顯子和7個內(nèi)含子，有13 000個堿基對，編碼248個氨基酸。近年來有學(xué)者研究用Ad-ING4感染多種腫瘤細胞，作用24～72h后可出現(xiàn)大量腫瘤細胞凋亡[4]。但目前有關(guān)外源性ING4對胃癌細胞的作用研究較少。為此，本研究用Ad-ING4（80、160、320ng/ml）干預(yù)人胃癌AGS細胞48h，顯示凋亡率均明顯高于對照組，并呈濃度依賴性。這與其他學(xué)者報道的Ad-ING4能明顯誘導(dǎo)膀胱癌T24細胞、非小細胞性肺癌細胞凋亡的結(jié)果類似。

研究表明，ING4基因通過p53基因依賴性途徑可抑制腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡[5]。一般認為其作用機制包括以下3個方面：一是ING4基因和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物p300結(jié)合誘導(dǎo)p53基因Lys-382的乙酰化，從而調(diào)節(jié)p53基因功能[6]；二是通過甲基化p53基因，抑制Mdnl2介導(dǎo)的p53基因，降解p53基因，并提高其下游基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的表達[7]；三是ING4基因與p53基因結(jié)合可提高其在Lys382位點的甲基化及轉(zhuǎn)錄活性[8]。另有學(xué)者研究認為超過60%的腫瘤發(fā)生，可能與p53基因的突變或缺失有關(guān)，其中約50%肺癌存在p53基因的突變[9]。為此，本研究探討在胃癌細胞中是否也存在ING4依賴性p53基因的改變，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Ad-ING4處理前，AGS細胞中p53基因表達相對較少，經(jīng)不同濃度的Ad-ING4處理后，p53 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達上調(diào)，而且隨著藥物濃度加大其轉(zhuǎn)錄及蛋白表達加強，提示人胃癌發(fā)生中p53基因的失活程度可能與胃癌細胞中ING4含量呈負相關(guān)。Ad-ING4誘導(dǎo)人胃癌AGS細胞凋亡與p53基因有關(guān)，且呈濃度相關(guān)性，這為臨床今后利用ING4作為靶基因治療胃癌提供了理論依據(jù)。但隨Ad-ING4濃度增高，p53基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性增強的具體機制仍需進一步研究。

[1]Li S,Fan T,Liu H,et al.Tumor suppressor ING4 overexpression contributes to proliferation and invasion inhibition in gastric carcinoma by suppressing the NF-κB signaling pathway[J].MolBiol ReP,2013,40(10):5723-5732.

[2]Huang J Y,CuiSY,ChenYT,etal.MicroRNA-650 was a prog-nostic factor in human lung adenocarcinoma and confers the docetaxel chemoresistance of lung adenocarcinoma cells via regulating bcl-2/bax expression[J].PLoS One,2013,8(8):e72615.

[3]Ling C,Xie Y,Zhao D,et al.Enhanced radiosensitivity of nonsmall-cell lung cancer(NSCLC)by adenovirus-mediated ING4 genetherapy[J].Cancer Gene Ther,2012,19(10):697-706.

[4]UnokiM,Kumamoto K,Takenoshita S,et al.Reviewing the current classification of inhibitor of growth family proteins[J].Cancer Sci, 2009,100(7):1173-1179.

[5]Moreno A,Palacios A,Orgaz J L,et al.Functional impact of cancer-associated mutations in the tumor suppressor protein ING4 [J].Carcinogenesis,2010,31(11):1932-1938.

[6]Shiseki M,Nagashima M,Pedeux R M,et al.p29ING4 and p28ING5 bind to p53and p300,and enhance p53 activity[J]. Cancer Res,2003,63(10):2373-2378.

[7]Russell M,Berardi P,Gong W,et al.Grow-ING,age-ING and die-ING:ING proteins link cancer,senescence and apoptosis[J]. Exp cellRes,2006,312(7):951-961.

[8]Zhang X,Wang K S,Wang Z Q,et al.Nuclear localization signal of ING4 plays a key role in its binding to p53[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,331(4):1032-1038.

[9]劉同陽,郭海強,朱美妍,等.突變型p53與其合成致死基因的研究進展[J].遺傳,2015,37(4):321-326.

Effects of Ad-ING4 on apoptosis and p53 expression in human gastric cancer AGS cells

CHENG Haiyan,SHEN Zhe.Department of Gastroenterology,Shaoxing Second Hospital,Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effects of adenovirus-mediated ING4(Ad-ING4)on apoptosis and expression of p53 gene in human gastric AGS cells. Methods AGS cells were treated with Ad-ING4 at different concentrations(80, 160,320ng/ml).Cell apoptosis was evaluated by AnnexinV-FITC/PI fluos stainging. Results AnnexinV-FITC/PI showed that the apoptosis rate in AGS cell went up significantly after treatment of Ad-ING4 in a dose dependent manner(P＜0.05).Compare to control group,the mRNA and protein expressions of p53 gene were increased in a dose dependent manner after treaded with Ad-ING4 at different concentrations(P＜0.05). Conclusion Ad-ING4 can induce apoptosis of gastric cancer AGS cells,which may be related to the enhancement of the transcriptional activity of p53 gene.

Ad-ING4 Human gastric cancer AGS cells Cellapoptosis p53 gene

2016-03-03）

（本文編輯：陳麗）

312000 紹興第二醫(yī)院消化內(nèi)科

沈哲，E-mail：Shenzhen@126.com