肌聚糖蛋白在前列腺增生患者膀胱逼尿肌中的表達

木海琦 朱詩建 楊森 南存金 陳映鶴

肌聚糖蛋白在前列腺增生患者膀胱逼尿肌中的表達

木海琦 朱詩建 楊森 南存金 陳映鶴

目的 探討肌聚糖蛋白α（α-SG）、肌聚糖蛋白β（β-SG）在良性前列腺增生癥（BPH）患者膀胱逼尿肌中的表達。方法 選擇67例住院手術的BPH患者為研究對象，根據排尿后膀胱殘余尿量分為尿潴留組31例（＞50ml）和非尿潴留組36例（＜50ml），并選擇同期住院、無BPH且排尿后膀胱內無殘余尿的男性膀胱惡性腫瘤患者28例為對照組；采集患者逼尿肌標本，采用免疫組化、Western blot法檢測α-SG、β-SG表達。結果 免疫組化顯示α-SG、β-SG免疫陽性產物呈棕黃色顆粒，主要位于細胞質，與膀胱逼尿肌細胞走向一致。與對照組相比，尿潴留組α-SG、β-SG表達水平均明顯下降，非尿潴留組均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論 SG在BPH患者膀胱逼尿肌中存在異常表達，可能與BPH臨床進展有關。

肌聚糖蛋白 前列腺增生 尿潴留

良性前列腺增生（BPH）是困擾中老年男性的常見疾病，臨床上表現為尿頻、尿急、排尿費力、尿流緩慢，甚至出現急慢性尿潴留等[1]。有研究表明，大約有1/3的BPH患者在就診時已存在膀胱失代償改變，這部分患者在梗阻解除后下尿路癥狀不能緩解。所以探索更敏感、更特異的診斷方法來判斷膀胱的狀態顯得尤為重要[2]。肌聚糖蛋白（SG）是非整合素家族成員之一，以肌營養不良蛋白復合物的形式將組織細胞與細胞外基質聯系在一起，起著信號轉導和結構整合的雙重作用[3]。本研究旨在觀察BPH患者膀胱逼尿肌中α-SG、 β-SG表達情況，探討SG表達在BPH患者診療過程中的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年1月至2015年4月因BPH在溫州醫科大學附屬第二醫院住院手術患者67例為實驗組，診斷依據參照《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》；年齡58～82（71.27±9.74）歲；國際前列腺癥狀評分表（IPSS）17～28（20.4±3.5）分；再根據排尿后膀胱殘余尿量分為尿潴留組31例（＞50ml）和非尿潴留組36例（＜50ml）。選擇同期入住該醫院的男性膀胱惡性腫瘤患者28例，排尿后膀胱內無殘余尿且排除伴有BPH者為對照組；年齡61～78（69.52±7.36）歲；IPSS 0～5（3.2±0.7）分。對照組與實驗組患者平均年齡差異無統計學意義（P＞0.05），且均無伴有影響膀胱功能的疾病；兩組患者IPSS差異有統計學意義（P＜0.05）。本研究經醫院倫理委員會同意批準，并獲得患者或其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人α-sarcoglycan單克隆抗體（ab189254）、鼠抗人β-sarcoglycan單克隆抗體（ab55683）均購自美國Abcam公司；HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG和β-actin均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光底物（ECL）購自美國Pierce公司。

1.2.2 標本采集 （1）實驗組：在行恥骨上前列腺摘除術中取膀胱前壁切口旁肌肉組織。（2）對照組：在行膀胱部分切除術或根治性膀胱切除術中切取膀胱前壁肌肉組織（避開膀胱腫瘤部位）。將切取的膀胱壁肌肉組織立即置入液氮罐中速凍，再轉入-80℃冰箱保存。

1.2.3 免疫組化檢測α-SG、β-SG表達 采用SABC法。組織脫蠟、階梯透明、檸檬酸鹽抗原修復后，3% H2O2及山羊血清封閉，稀釋后的一抗4℃過夜，二氨基聯苯胺法（DAB）染色，蘇木素復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。每張切片觀察4個不重復視野，計算陽性細胞數（棕黃色顆粒物）；用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 Western blot檢測α-SG、β-SG表達水平 采用BCA法。用含PMSF的蛋白裂解液提取組織中的蛋白，每個槽孔內上樣20μl，進行SDS-PAGE凝膠電泳、恒壓轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h；加入稀釋后的一抗，4℃冰箱搖床過夜，加入相應的二抗，ECL化學發光、顯影、定影。使用Bio-Rad Quantity軟件分析測定其區帶的吸光度，以β-actin為內參對照，用目的片段與β-actin的吸光度比值表示蛋白表達水平。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 膀胱逼尿肌中α-SG、β-SG表達情況 免疫組化檢測顯示α-SG、β-SG免疫陽性產物呈棕黃色顆粒，主要位于細胞質，與膀胱逼尿肌細胞走向一致。與對照組相比，尿潴留組的α-SG、β-SG陽性細胞比例下降，非尿潴留組的α-SG、β-SG陽性細胞比例增加，見圖1-2。

圖1 各組膀胱逼尿肌中α-SG表達免疫組化所見（a：對照組；b：尿潴留組；c：非尿潴留組；SABC法，×400）

圖2 各組膀胱逼尿肌中β-SG表達免疫組化所見（a：對照組；b：尿潴留組；c：非尿潴留組；SABC法，×400）

2.2 膀胱逼尿肌中α-SG、β-SG表達水平 與對照組相比，尿潴留組α-SG、β-SG表達水平均明顯下降（均P＜0.05）；非尿潴留組α-SG、β-SG表達水平均明顯增加（均P＜0.05），見圖3和表1。

圖3 各組膀胱逼尿肌中α-SG、β-SG表達Western blot檢測電泳圖（a：對照組；b：尿潴留組；c：非尿潴留組）

表1 α-SG、β-SG在各組膀胱逼尿肌中的表達水平

3 討論

前列腺增生是老年男性常見病和多發病，隨著年齡增長，BPH發病率逐漸增高。前列腺體積增大導致后尿道延長、狹窄、變形，使尿液流出道阻力升高，從而引起膀胱內高壓；為克服BPH引起的膀胱排空阻力，逼尿肌對梗阻的早期反應是平滑肌代償性肥大，這是對膀胱內壓力增加的一種代償性反應，即當流出道阻力增加時，為維持尿流率，逼尿肌收縮力增強、壓力升高，這是以犧牲膀胱的貯存尿液功能為代價，易引起儲尿期癥狀如尿頻、尿急、夜尿增多、尿失禁等[4]。如果梗阻不能及時解除，膀胱在長期過度牽張狀態下，逼尿肌會出現纖維化、肌纖維斷裂和排列紊亂等一系列變化，使得逼尿肌收縮功能異常，進入失代償性狀態，出現急慢性尿潴留，部分患者在梗阻解除后下尿路癥狀不能緩解[5]。相關研究發現BPH相關的膀胱逼尿肌病理生理變化是引起下尿路癥候群的關鍵，逼尿肌形態結構的病變是其功能改變的前提和基礎[3-6]。

SG是非整合素家族成員之一，是一種黏附分子，廣泛表達于骨骼肌、心肌等組織中。人們最早在一些骨骼肌營養不良患者中發現SG表達異常，認為肌膜組織結構的穩定與SG蛋白正常糖基化相關[7]。此外，SG可能在維持肌細胞鈣離子平衡、對其他信號功能的發展和維護方面起著關鍵作用[8]。Arena等[9]發現原發性膀胱輸尿管反流與α-SG過表達有關，可能機制與SG蛋白過表達后平滑肌功能亢進相關。Cutroneo等比較前列腺癌組織與正常前列腺腺體中SG蛋白表達水平，發現前列腺癌組織中SG蛋白表達下調，推斷前列腺癌細胞的生物學行為與SG表達下調存在關聯[10]。在乳腺纖維瘤[11]、擴張性心肌病[12]中同樣存在SG蛋白表達下調的現象。Wei等建立雄兔BOO模型實驗發現當梗阻達到一定時間后，逼尿肌中β-SG、γ-SG蛋白表達下降[13]。

基于以上發現，筆者推測SG蛋白可能參與了BPH患者從“代償期”到“失代償期”的發展過程。筆者收集并分析了不同狀態下的逼尿肌，運用分子生物學技術檢測α-SG、β-SG蛋白表達水平，免疫組化和Western blot檢測結果均顯示尿潴留組α-SG、β-SG蛋白表達水平低于對照組（均P＜0.05），非尿潴留組α-SG、β-SG蛋白表達水平高于對照組（均P＜0.05）。這表明在正常逼尿肌功能狀態發展成為失代償狀態的過程中伴隨著SG蛋白表達水平的改變。根據現有研究結果提出假設，SG蛋白的異常表達在BPH臨床進展中起著關鍵作用，且通過影響細胞與細胞外基質之間的信息傳遞，從而影響單個平滑肌細胞的收縮能力和細胞間的收縮傳導，使整個逼尿肌不能產生有效的收縮，最終導致臨床上急慢性尿潴留的發生。對于SG蛋白的研究目前仍處于實驗探索階段，關于如何應用于臨床有待進一步探索。

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Expression of sarcoglycans in detrusor of bladder in patients with benign prostatic hyperplasia

MU Haiqi,ZHU Shijian,YANG Sen, et al.Department of Urology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Objective To investigate the expression of α-sarcoglycan(α-SG)and β-sarcoglycan(β-SG)in detrusor of bladder in patients with benign prostatic hyperplasia(BPH) Methods Sixty seven patients with BPH were enrolled in the study, including 31 cases with urinary retention(＞50ml),and 36 cases without urinary retention(＜50ml),and 28 bladder tumor patients without BPH and urinary retention as control group.The expressions of α-SG,β-SG in detrusor tissue were detected by immunohistochemical technique and Western blot. Results Immunohistochemistry showed that positive staining of α-SG, β-SG was mainly present in the cytoplasm,and arrayed along bladder detrusor cells.Compared to the control group,the expression of α-SG,β-SG in detrusor in urinary retention group was decreased (P＜0.05),while the expression in non-urinary retention group was increased (P＜0.05). Conclusion The abnormal expression of sarcoglycans in the detrusor of bladder is associated with the clinical progress of BPH patients.

Sarcoglycan Benign prostatic hyperplasia Urinary retention

2016-04-28）

（本文編輯：陳丹）

溫州市公益性科技計劃項目（Y20150219）

325027 溫州醫科大學附屬第二醫院泌尿外科（木海琦、楊森、南存金、陳映鶴）；溫州醫科大學附屬蒼南醫院（朱詩建）

陳映鶴，E-mail：chenyh@wzhealth.com