紅豆杉多糖對免疫功能低下小鼠細胞免疫功能的影響

朱慧民 李露露 蔡遠榛 陳琪 陳華群 張婭麗

紅豆杉多糖對免疫功能低下小鼠細胞免疫功能的影響

朱慧民 李露露 蔡遠榛 陳琪 陳華群 張婭麗

目的 探討紅豆杉多糖增強免疫低下小鼠免疫功能的機制。方法 將48只昆明小鼠按隨機數字表法分為正常對照組，氫化可的松模型組，紅豆杉多糖低、中、高劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組，每組8只。除正常對照組外，其余各組小鼠皮下注射氫化可的松0.2mg/kg，隔天1次，共14 d，制備小鼠免疫功能低下模型。正常對照組和氫化可的松模型組予0.9%氯化鈉溶液10ml/kg灌胃，紅豆杉多糖低、中、高劑量組分別予等量不同濃度10、20、40mg/ml紅豆杉多糖溶液灌胃，猴頭菇多糖陽性對照組予等量濃度為1.1mg/ml猴頭菇多糖溶液灌胃,均1次/d，連續14d。流式細胞術檢測小鼠血CD4+、CD8+細胞百分比，ELIAS法檢測血清IL-4水平，測量小鼠胸腺指數。結果 與正常對照組比較，氫化可的松模型組CD4+、CD8+細胞百分比均明顯降低（P＜0.01），紅豆杉多糖低、中、高劑量組與氫化可的松模型組對比，CD4+、CD8+細胞百分比均有所增加（均P＜0.05），其中紅豆杉多糖中劑量組能降低CD4+/CD8+比值（P＜0.05）。與正常對照組比較，氫化可的松模型組血清IL-4水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；紅豆杉多糖低、中、高劑量組IL-4水平均高于氫化可的松模型組（P＜0.05或0.01）。氫化可的松模型組與正常對照組比較，胸腺指數明顯降低（P＜0.01）。紅豆杉多糖低、中、高劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組與氫化可的松模型組比較，胸腺指數均有所增加（P＜0.05），其中紅豆杉多糖中劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組均明顯增高（P＜0.01）。結論 紅豆杉多糖增強細胞免疫的機制它可能主要通過調節細胞免疫來增強免疫低下小鼠的免疫功能。

紅豆杉多糖 T淋巴細胞亞群 胸腺指數 小鼠

紅豆杉是我國一級保護植物，具有較高的觀賞及藥用價值，其樹皮是抗腫瘤藥物紫杉醇的原料，但大量的紅豆杉在樹皮提取紫杉醇后便被遺棄，造成資源的極大浪費。本課題組與浙江大學及省內企業合作首次以極性梯度提取技術從紅豆杉科、紅豆杉屬植物南方紅豆杉中發現、提純并分離出“紅豆杉多糖”（已獲國家發明專利授權：03129421.9），并在近年研究中逐步完成其毒理學、藥效學、藥代學研究，發現該多糖具有抗腫瘤[1]、抗糖尿病[2]、抗氧化等作用，同時發現其具有干預心肌缺血再灌注損傷等生物學特性和功能[3-5]。筆者在前期研究中，發現紅豆杉多糖可增強免疫功能低下小鼠的相關免疫功能[6]。現進一步探討這一作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 昆明小鼠48只，7周齡，22～25g,雄性清潔級，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SYXK（浙）2010-0150。低速離心機（安徽中科中佳科學儀器公司），電熱恒溫水箱（一恒儀器公司），漩渦混合器（上海醫大儀器廠），酶標儀（美國Aurobiio公司），全自動酶標洗板機（匯松儀器廠），流式細胞儀（美國BD公司）。抗小鼠CD8+（PE）、抗小鼠CD4+（PE）、小鼠IL-4 ELIAS試劑盒（武漢博士得生物有限公司），猴頭菇多糖（中國無限極有限公司，含量90%）粉劑5g，紅豆杉多糖（浙江省中醫藥研究所，含量90%）粉劑5g。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與干預 按隨機數字表法將48只小鼠分為6組：正常對照組，氫化可的松模型組，紅豆杉多糖低、中、高劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組，每組8只。氫化可的松模型組、猴頭菇多糖陽性對照組及紅豆杉多糖低、中、高劑量組小鼠皮下注射氫化可的松0.2mg/kg，隔天1次，共14d，完成造模[8]。于造模第1天起，正常對照組及氫化可的松模型組小鼠予0.9%氯化鈉溶液10ml/kg灌胃；紅豆杉多糖低、中、高劑量組小鼠予等量紅豆杉多糖溶液（將粉劑溶于0.9%氯化鈉溶液配置不同濃度10、20、40mg/ml）等量灌胃；猴頭菇多糖陽性對照組小鼠予等量猴頭菇多糖溶液（將粉劑用0.9%氯化鈉溶液配置濃度1.1mg/ml）灌胃，均1次/d，連續14d[9]。

1.2.2 T淋巴細胞亞群的檢測 末次給藥后12h，各組小鼠眼眶取血50μl加入流式管中，并加以4%EDTANa2抗凝，再取PE-CD4-Ab、PE-CD8-Ab各3μl，依次加入流式管中，混勻后避光15min，結束后加入200μl紅細胞裂解液，渦輪震蕩，再次避光孵育10min，結束后離心3 000r/min，棄上清液，加入500μlPBS，暗室室溫下孵育10min，流式細胞儀測定CD4+、CD8+細胞百分比。

1.2.3 血清IL-4水平的測定 末次給藥12h后，摘眼球采血0.5ml，按組別裝入EP管，肝素抗凝，4℃3 000r/ min離心3min，標本分為血清及血細胞沉淀，取血清，采用ELIAS法，按試劑盒說明書方法操作，酶標儀450nm處檢測吸光度A值，繪制出標準曲線，計算IL-4水平。

1.2.4 胸腺指數測量 末次給藥12 h后，稱量小鼠體重，摘取小鼠胸腺組織，濾紙吸干殘血后稱重（mg），分別除以小鼠體重，再乘以10，得到小鼠胸腺指數。

1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表達，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠的一般情況 造模與干預結束后，氫化可的松模型組小鼠可見皮膚松弛，進針處皮膚潰爛，精神萎靡，活動度差，進食差；正常對照組小鼠皮膚緊實，無精神萎靡、進食差等表現；紅豆杉多糖低、中、高劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組小鼠也可見皮膚松弛，但較氫化可的松模型組程度輕，進針處皮膚有潰爛，面積較氫化可的松模型組小，活動度尚可，進食可。

2.2 各組小鼠T淋巴細胞亞群的比較 與正常對照組比較，氫化可的松模型組CD4+、CD8+細胞百分比均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.01），說明氫化可的松成功建立免疫低下小鼠的模型。紅豆杉多糖高、中、低劑量組及猴頭菇陽性對照組CD4+、CD8+細胞百分比均高于氫化可的松模型組，差異均有統計學意義（P＜0.05或0.01），且以中劑量組升高更為顯著；紅豆杉多糖中劑量組及猴頭菇多糖陽性對照組均能降低CD4+/CD8+比值，與氫化可的松模型組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）；紅豆杉多糖高、低劑量組與氫化可的松模型組比較CD4+/CD8+比值有降低，但差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表1。

表1 各組小鼠T淋巴細胞亞群的比較

2.3 各組小鼠血清IL-4水平的比較 與正常對照組比較，氫化可的松模型組血清IL-4水平明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）。紅豆杉多糖低、中、高劑量組IL-4水平均高于氫化可的松模型組（P＜0.05或0.01），詳見表2。

表2 各組小鼠血清IL-4水平的比較（pg/ml）

2.4 各組小鼠胸腺指數的比較 與正常對照組比較，氫化可的松模型組胸腺指數明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；猴頭菇多糖陽性對照組及紅豆杉多糖低、中、高劑量組胸腺指數均高于氫化可的松模型組（P＜0.05或0.01），詳見表3。

表3 各組小鼠胸腺指數的比較

3 討論

免疫器官的重量是反應機體非特異性免疫功能的重要指標，免疫抑制劑可造成機體免疫器官重量下降或者功能低下，而免疫促進劑可使免疫器官的重量恢復正常，胸腺的主要功能是產生T淋巴細胞和分泌胸腺素，從而調節細胞免疫功能。目前胸腺指數成為判斷體內細胞免疫水平的一項重要指標[10]。細胞免疫為T細胞受到抗原刺激后，分化、增殖、轉化為致敏T細胞，當相同抗原再次進入機體，致敏T細胞對抗原有直接殺傷作用，T細胞所釋放的淋巴因子有協同殺傷作用。T淋巴細胞亞群是細胞免疫的主要細胞，可分為細胞毒性T細胞（CD8+T細胞）、輔助性T細胞（CD4+T細胞）和抑制性T細胞。目前發現體內多數細胞因子可通過促進T淋巴細胞亞群的增殖及分化直接增強T細胞介導的細胞免疫反應，還可激活T淋巴細胞亞群分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4等細胞因子增強殺傷性T細胞、NK細胞等的殺傷活性，協同B細胞增殖及分泌抗體，同時在一定程度上可刺激誘導活化的CD4+細胞和CD8+細胞，進一步調節CD4+/CD8+細胞比例，從而起到調節細胞免疫功能的作用[11-12]。故T淋巴細胞亞群的檢測分析是判斷細胞免疫功能的一個重要方法，正常機體內CD4+細胞和CD8+細胞保持一定的比例，當兩者比例失衡，即可產生免疫功能紊亂。

本研究發現，低、中、高劑量紅豆杉多糖均能明顯提高氫化可的松誘導的免疫功能低下小鼠的胸腺指數水平，其中猴頭菇多糖陽性對照組及紅豆杉多糖中劑量組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；紅豆杉多糖對免疫低下小鼠的CD4+、CD8+淋巴細胞有促進增殖的能力；同時進一步研究發現紅豆杉多糖低、中、高劑量組IL-4水平均高于氫化可的松模型組（P＜0.05或0.01），提示紅豆杉多糖改善免疫功能低下小鼠細胞免疫功能。

綜上所述，紅豆杉多糖能提高免疫功能低下小鼠的胸腺指數及IL-4水平，對CD4+、CD8+淋巴細胞有促進增殖的能力，可能是通過調節細胞免疫來增強免疫功能低下小鼠的免疫功能。

[1] 張薇,熊耀康.南方紅豆杉多糖的測定[J].浙江中醫雜志,2009,44(9): 686-687.

[2] 張學玉,曲瑋,梁敬鈺.紅豆杉屬植物化學成分及藥理作用研究進展[J].海峽醫藥,2011,23(6):5-9.

[3] 王亞飛,王強,阮曉,等.紅豆杉屬植物資源的研究現狀與開發利用對策[J].林業科學,2012,48(5):116-125.

[4] Wu M B,Wu YL,Zhou J,et al.Structuralcharacterisation of awater-soluble polysaccharide with high branches from the leaves of Taxus chinensis var.mairei[J].Food Chemistry,2009,113(1):1020-1024.

[5] 朱天民,朱慧民,李輝,等.紅豆杉多糖對CI-V/I犬心肌缺血再灌注模型心肌細胞凋亡及單核細胞趨化蛋白-1與NO表達的影響[J].中草藥, 2010,41(5):778-781.

[6] 蔡遠榛,朱慧民,陳琪,等.紅豆杉多糖對小鼠免疫功能的影響[J].上海中醫藥大學學報,2015,29(2):58-60.

[7] 賀新懷.中醫藥免疫學[M].北京:軍醫出版社,2002:94-95.

[8] 劉丹丹,鄭豐渠,苗明三,等.大棗多糖對氫化可的松致小鼠免疫抑制模型免疫功能的影響[J].中醫學報,2011,26(158):809-810.

[9] 羅珍,黃萍,郭重儀,等.猴頭菇多糖增強免疫功能的實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(4):182-183.

[10] 劉穎,敬岳,郭麗麗,等.固本止咳中藥對COPD模型小鼠脾、胸腺指數及Th1/Th2失衡的影響[J].中華中醫藥雜志,2015,10(2):137-139.

[11] Ma Z,Qin H,Benveniste E N,et al.Transcriptionalsuppression of matrix metalloproteinase-9 gene expression by IFN-y and 1FN-P:critical role of STAT-1 a[J].J Immunol,2001,167(90): 5150-5159.

[12] Zhou M,Zhang Y,Jeanette A,et al.Interferon-y differentially regulates monocyte matrix metalloproteinase21 and 29 through tumor necrosis factora and caspase[J].J Biol Chem,2003,278 (7):45406-45413.

Effects of taxus polysaccharide on cellular immunity of immunosuppressed mice

ZHU Huimin,LI Lulu,CAI Yuanzhen,et al. Department of Geriatric Medicine，Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province,the Second Clinical Medical Conllege of Wenzhou Medical University,Taizhou 318000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of taxus polysaccharide on cellular immunity of immunosuppressed mice. Methods Forty-eight male Kunming mice were divided into 6 groups.Five groups of mice were administered with hydrocortisone (Hy)(0.2mg·kg-1q.o.d x14d s.c)to induce immunosuppression,3 of these groups received taxus polysaccharide treatment (10mg/ml,20mg/ml,40mg/ml),1 group received polysaccharide of hericium erinaceusthe(HEP),1 group received normal saline (NS).Serum CD4+,CD8+levels were detected by flow cytometry,and the thymus index was measured. Results The number of CD4+T cells,CD8+T cells were significantly reduced in Hy-groups compared with normal group,but in high-dose,and middle-dose the number of CD4+T cells,CD8+T cells was significantly increased(P＜0.01),the CD4+/CD8+ratio was decreased in middle dose group compared with model group (P＜0.05).Compared with control group,thymus index was elevated in treatment groups(P＜0.05),which was more markedly in the middle dose group(P＜0.01). Conclusion Taxus polysaccharide can improve the cellular immunity in immunodepressed mice.

Taxus polysaccharide T-lymphocyte Thymus index Mice

2015-12-21）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省臺州市科技局科技計劃基金（111ky7-2）

318000 臺州市中心醫院老年醫學科,溫州醫科大學第二臨床醫學院（朱慧民）；溫州醫科大學第二臨床醫學院（李露露）；臺州市中心醫院老年醫學科（陳琪、陳華群、張婭麗）；寧波第七醫院心內科（蔡遠榛）

朱慧民，E-mail：hkat@163.com