單核細胞趨化蛋白-1基因多態性與浙江局部地區漢族人群2型糖尿病的相關性研究

馬江波 許鑫 馬改改 沈潔 黃青華 施育平

單核細胞趨化蛋白-1基因多態性與浙江局部地區漢族人群2型糖尿病的相關性研究

馬江波 許鑫 馬改改 沈潔 黃青華 施育平

目的 探討單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）基因多態性與浙江局部地區漢族人群2型糖尿病（T2DM）的相關性。方法 采用病例對照研究，選取浙江局部地區漢族人群中T2DM患者208例（T2DM組）和健康體檢者209例（對照組），采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法檢測受試者CCL2 rs1024611（-2518A/G）的基因型，并用DNA測序法鑒定部分結果。結果CCL2 rs1024611基因多態性與T2DM發生相關，T2DM組和對照組G基因頻率差異有統計學意義（P＜0.01），T2DM組和對照組GG基因型頻率差異有統計學意義（P＜0.01），多因素logistic回歸分析顯示，GG基因型頻率可顯著降低T2DM風險（校正后OR=0.201，95%CI：0.077～0.526，P＜0.01）。結論 CCL2 rs1024611基因多態性與T2DM發生相關，其中GG基因型可能是T2DM的保護性因素，G等位基因可能降低漢族浙江局部地區漢族人群T2DM的風險。

單核細胞趨化蛋白-1 2型糖尿病 單核苷酸多態性

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2009年10月至2014年10月入住浙江省人民醫院內分泌科的T2DM患者208例，男143例，女65例，年齡55～76（65.8±10.1）歲。符合1999年WHO關于T2DM診斷標準，同時排除感染、心腦血管疾病、自身免疫性疾病、非糖尿病引起的腎功能衰竭、惡性腫瘤患者。選擇性別、年齡相匹配的同期浙江省人民醫院門診健康體檢者209例作為對照組，男143例，女66例，年齡53～74（63.9±10.6）歲。本研究所有受試者均為中國浙江地區漢族人，個體之間無血緣關系。兩組性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。所有入選者均征得本人或其家屬同意并簽署知情同意書。本研究獲得浙江省人民醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 白細胞基因組DNA提取 所有對象采集晨起空腹靜脈血5ml 2管，其中一管測定血糖、糖化血紅蛋白（HbA1c）、血脂等，另一管以EDTA抗凝，以溶液鹽析法提取DNA，TE溶解，-80℃保存。

1.2.2 CCL2 rs1024611多態性檢測 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）技術方法參考文獻[8-10]。應用上游引物5′-TCT CTC AGC CCA GCA CTG ACC-3′和下游引物 5′-GAG TGT TCA CAT AGG CTT CTG-3′擴增包含CCL2 rs1024611（-2518A/ G）位點的DNA片段234 bp。當-2518位點為G等位基因時，PCR產物由限制性內切酶PvuⅡ（加拿大生工公司）切割產生2個片段：159 bp和75 bp。隨機選擇20%的T2DM組和20%的對照組，將每個樣本的PCR擴增片段送至上海生工生物工程有限公司，采用ABI_3730XL測序儀（美國ABI公司）進行單向測序。DNA測序圖譜中多態性位點僅有一個G或A峰，表示其為純合GG或AA型；出現雙峰則表示其為雜合GA型測序得到的基因型與采用PCR-RFLP得到的基因型進行比對，詳見圖1。

圖1 CCL2rs1024611（-2518A/G）瓊脂糖電泳及測序結果[a：M：DL500 DNA分子標志物；1、4、5、6、7：AG型；2、8：AA型；3：GG型；b：小方框位置為多態性位點]

1.3 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件。運用Hardy-Weinberg平衡檢驗確認研究樣本的群體代表性。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。以比值比（OR）及其95%可信區間（CI）表示相對風險度。通過非條件logistic回歸分析校正危險因素后估算基因型與表型的相關性。未校正的OR值和校正后的OR值分別采用單因素分析和多因素logistic回歸分析。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 CCL2 rs1024611在對照人群中的基因分型符合Hardy-Weinberg平衡規律（CCL2：χ2=2.01，P=0.156），表明對照人群的基因分布可反映整體人群基因的分布情況。

2.2 兩組對象一般資料的比較 在T2DM組中BMI、TG及LDL-C水平均高于對照組（均P＜0.05），而HDLC水平低于對照組（P＜0.05）。T2DM組中空腹血糖和HbA1c高于對照組（P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組對象一般資料的比較

2.3 兩組CCL2 rs1024611（-2518A/G）基因型和等位基因頻率的比較 兩組CCL2 rs1024611的基因型和等位基因頻率分布見表2。T2DM組和對照組G基因頻率差異有統計學意義（P＜0.01）。T2DM組和對照組GG基因型頻率差異有統計學意義（P＜0.01），經非條件logistic回歸分析校正BMI及血脂水平后，CCL2-2518 GG基因型能顯著降低發生T2DM的風險，為T2DM的保護性因素。

表2 兩組CCL2rs1024611（-2518A/G）基因型和等位基因頻率的比較

3 討論

T2DM呈復雜性遺傳模式，即多個基因變異加上環境因素的影響共同決定疾病的易感性。近年提出的T2DM的炎癥學說，認為T2DM是一種慢性非特異性炎癥過程。而MCP-1對各種炎癥細胞有趨化激活作用。本研究分析了浙江局部地區漢族人群CCL2 rs1024611（-2518A/G）基因多態性與T2DM的關系，研究結果表明，CCL2 rs1024611(-2518A/G)基因多態性與漢族人群T2DM發生相關，其中GG基因型可能是T2DM的保護性因素，G等位基因可能降低浙江局部地區漢族人群T2DM的風險。

對于MCP-1-2518A/G基因多態性與T2DM的關聯研究國內外也有相關報道。本研究中對照組AA、AG、GG基因型分別為22.0%、44.5%、33.5%，這與Jiang等[9]報道的中國人群（病例數416）研究結果無統計學差異，然而與國外Simeoni[11]、Zietz等[12]報道的研究結果相比，G等位基因頻率高于高加索人群，提示該基因變異存在種族異質性。

2004年，Simeoni等[11]對大樣本量的高加索人群研究后發現，血漿MCP-1水平升高與胰島素抵抗和T2DM發生呈顯著正相關，MCP-1 G-2518等位基因作為一種胰島素抵抗和T2DM負效因子有統計學意義。Jing等[9]對中國人群的研究亦與本研究結果一致，均表明G等位基因可能為T2DM的保護性因素。然而，Zietz等[12]對高加索人群的另一項研究卻未發現MCP-1-2518A/G基因多態性與T2DM相關。其原因可能有：首先，部分研究樣本量太小，導致統計效能低，其研究結果可信度不高；其次，糖尿病的不同表型可能有不同的遺傳發病機制，目前已有多項研究報道MCP-1基因多態性與糖尿病微血管病變、糖尿病腎病、糖尿病大血管病變等糖尿病并發癥相關，若納入研究的T2DM表型不一致，是否合并糖尿病并發癥可能導致結果的差異。

關于MCP-1基因多態性與T2DM關聯的機制研究主要集中在不同基因型其MCP-1表達水平的差異方面。研究表明，MCP-1-2518A/G位點的基因多態性影響炎癥刺激反應中MCP-1的表達水平[6]。Simeoni等[11]研究也表明，T2DM患者體內MCP-1水平顯著高于正常對照。MCP-1是炎癥趨化因子CC亞族的一員，對各種炎性細胞尤其是單核/巨噬細胞具有趨化激活作用，研究發現脂肪組織可以產生MCP-1，當脂肪沉積到達一定閾值時，來自脂肪細胞的因子，如TNF-α、MCP-1等引起巨噬細胞激活和浸潤，激活的巨噬細胞分泌各種炎癥因子，后者可損傷脂肪細胞胰島素敏感性，同時刺激周圍單核細胞和巨噬細胞進一步激活和浸潤脂肪，最終引起全身胰島素抵抗[5]。因此作為一種重要的前炎癥細胞因子，MCP-1在炎癥-胰島素抵抗型-糖尿病的病理生理過程中起著重要作用。然而，Zietz等[12]研究卻發現，T2DM患者體內MCP-1水平顯著升高，但MCP-1-2518A/G基因型和等位基因頻率與非糖尿病人群比較差異無統計學意義，與MCP-1水平也無相關性，提示MCP-1水平可能只是MCP-1-2518A/G基因型影響T2DM的發生和發展的部分原因，關于其完整和詳盡的機制還有待進一步的研究。

綜上所述，本研究從一定角度揭示了 CCL2 rs1024611基因多態性可能與浙江局部地區漢族人群T2DM發生相關，其中GG基因型可能是T2DM的保護性因素，G等位基因可能降低浙江局部地區漢族人群T2DM的風險，但由于T2DM屬多基因遺傳性疾病，每個易感基因的作用可能都是微小的，而且本研究的研究人群并非來自社區，雖然有明確的排除標準，但住院患者糖尿病并發癥發生率顯然大于一般人群，這對研究結果造成了一定的偏倚。因此，有必要擴大研究對象的數量，為進一步從基因水平揭示MCP-1基因與糖尿病的關系提供依據。

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（本文編輯：嚴瑋雯）

Association of monocyte chemoattractant protein-1 gene polymorphism with risk of type 2 diabetes mellitus in Han population in Zhejiang province

MA Jiangbo,XU Xin,MA Gaigai,et al. Department of Endocrinology,Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310009，China

【 Abstract】 Objective To investigate the association of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)gene rs1024611 (-2518A/G)polymorphisms with risk of type 2 diabetes mellitus(T2DM)in Han population of Zhejiang province. Methods A total of 208 patients with T2DM and 209 healthy control subjects in Han population of Zhejiang province were enrolled in this study.Genotyping wasperformed by polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism and subsequently confirmed by DNA sequencing.Odds ratio(OR)and 95%confidence intervals(CI)were calculated for the risk of genotypes and alleles. Results MCP-1 gene polymorphism rs1024611(-2518A/G)was conformed to the Hardy-Weinberg equilibrium.The statistical differences in the G allele(43.7%vs.55.7%,P＜0.01)and GG genotype(19.2%vs.33.5%,P＜0.01) were found between T2DM patients and controls.The GG genotype was associated with a decreased risk of T2DM(OR=0.201, 95%CI:0.077-0.526,P＜0.01). Conclusion The MCP-1 gene rs1024611(-2518A/G)may be associated with T2DM susceptibility in Han population of Zhejiang province;GG genotype may be the protect factor for T2DM and G allele may reduce the risk of T2DM.

Monocyte chemoattractant protein-1 Type 2 diabetes mellitus Single nucleotide polymorphism

310009 杭州，浙江省人民醫院內分泌科（馬江波、沈潔、黃青華）；浙江大學醫學院附屬兒童醫院兒童保健科（許鑫）；浙江大學醫學院附屬第二醫院心內科（馬改改、施育平）

施育平，E-mail：shiyuping007@hotmail.com不一致，且針對漢族人群的該基因多態性缺少系統性研究，目前僅有Jing等[9]針對江蘇地區人群（病例數416）進行過系統研究。筆者擬探討CCL2 rs1024611基因多態性與浙江局部地區漢族人群T2DM易感性的關系，在不同人群中對該基因多態性與T2DM相關性進行驗證，進一步探討T2DM發生的病理生理機制。

2016-01-18）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種由遺傳因素和環境因素共同參與、相互作用所導致的慢性復雜代謝性疾病。近年來一些學者發現許多炎癥因子與胰島素抵抗、T2DM及其并發癥的發生、發展密切相關，進而提出了T2DM的炎癥學說，認為T2DM是一種慢性非特異性炎癥過程[1-4]。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）是炎癥趨化因子CC亞族的一員，對各種炎性細胞尤其是單核/巨噬細胞具有趨化激活作用，研究發現MCP-1作為一種胰島素反應因子，在炎癥-胰島素抵抗-T2DM的病理生理過程中起著重要作用[5]。人類CCL2基因位于染色體17q11.2-q12上，位于遠端調控區的SNP位點rs1024611（-2518A/G）能影響MCP-1的表達[6]。近年來有國內外研究報道，MCP-1-2518A/G基因多態性與胰島素抵抗、T2DM及其并發癥相關[7-9]，然而研究結果尚