NLRP3炎性體相關分子表達與老年2型糖尿病的關系

洪寶建 蘇麗韞 梁麗娟 朱月霞 徐芳 陳建忠

NLRP3炎性體相關分子表達與老年2型糖尿病的關系

洪寶建 蘇麗韞 梁麗娟 朱月霞 徐芳 陳建忠

目的 研究核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體相關分子表達與老年2型糖尿病（T2DM）的關系。方法 采用ELISA法測定30例老年T2DM患者、30例健康體檢者（對照組）血漿中IL-1β、IL-18和IL-37水平，分別采用定量聚合酶鏈反應（PCR）技術和ELISA技術檢測糖尿病患者單核細胞來源的巨噬細胞（MDM）表達NLPR3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和IL-1β mRNA水平及葡萄糖誘導MDM分泌IL-1β和TNF-α的水平。結果 老年T2DM患者血漿中的IL-1β和IL-18水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而IL-37無統計學差異；T2DM患者MDM中NLPR3、ASC和IL-1β mRNA表達水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；且經葡萄糖刺激后IL-1β、TNF-α水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（均P＜0.05）。結論 NLRP3炎性體相關分子的表達與炎性體活化可能參與老年T2DM的炎癥反應過程。

白細胞介素-1β 2型糖尿病 核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 炎性體 腫瘤壞死因子

我國糖尿病患者已超過9 200萬，此外尚有約1.48億人處于糖尿病前期，有發展為糖尿病的趨勢。2型糖尿病（T2DM）是一種多基因遺傳性、進展性疾病，盡管其發病機制尚未完全明了，但是越來越多的實驗結果和臨床研究證明炎癥與免疫是T2DM發生、發展的驅動力[1-3]。近年來有學者提出核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）介導的炎性體激活途徑在T2DM發生、發展過程中起著重要的作用[4-10]，筆者通過觀察老年T2DM患者NLRP3炎性體相關分子的表達以及葡萄糖刺激劑對巨噬細胞炎性體活化途徑的作用，探討NLRP3炎性體活化途徑在T2DM發病中的作用，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2014年1月至2015年6月在浙江省人民醫院門診及住院的老年T2DM患者共30例，男13例，女17例，年齡62～89（76.3±14.5）歲。所有患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標準，初診，未經任何降糖藥物等治療。排除嚴重心、肝、腎疾病、糖尿病慢性并發癥、急性和慢性感染、近期手術和創傷、惡性腫瘤、自身免疫病以及其他內分泌系統疾病。選取浙江省人民醫院同期健康體檢者30例作為對照組，男16例，女14例，年齡56～85（74.6±13.4）歲；排除T2DM、動脈粥樣硬化、痛風病等疾病。兩組性別、年齡差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 T2DM患者入院后清晨空腹抽取靜脈血5ml，健康對照組于健康體檢時抽取，肝素抗凝，充分混勻后，以1 200r/min離心10min，將血漿和紅細胞迅速分離，將血漿置于EP管，置于4℃冰箱保存，用于檢測IL-1β、IL-18和IL-37含量。

1.2.2 外周血單個核細胞分離 采用密度梯度離心法分離T2DM患者和健康對照組的單個核細胞，分化為巨噬細胞（MDM），提取總RNA，采用定量PCR檢測MDM NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、IL-1β mRNA表達。用葡萄糖刺激患者和對照組的MDM，采用ELISA技術檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1β水平。

1.2.3 定量PCR檢測 參考文獻[7]設計和合成引物，詳見表1。

表1 引物序列

1.2.4 RNA的提取、反轉錄及熒光定量PCR 根據Trizol試劑盒說明書提取總RNA，加入20μl的DEPC水溶解，測定RNA濃度和光密度比值（OD），符合要求后按照試劑盒說明書進行逆轉錄反應，10μl反應體系中包括 PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 1μl，5xPrimeScriptTMBuffer 2μl，RNA 2μl，引物1μl，DEPC水4μl，反應物4℃儲存待用。根據參考文獻[7]在ABI 7500定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR檢測，20μl反應體系中含SYBR Premix Ex TaqTMII（2×）10μl，PCR上游和下游引物各1μl，逆轉錄反應液（cDNA溶液）2μl，DEPC水6μl，反應條件為95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環；每個樣品設定3個復孔，并使用熔解曲線分析引物特異性。用2-△△Ct法計算出每組樣本的基因表達量，每種檢測重復3次。

1.2.5 細胞因子檢測 采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）檢測外周血IL-1β、IL-18和細胞培養上清液TNF-α、IL-1β水平，按試劑盒說明操作，酶標儀（美國BIO-RAD公司）測定450nm處吸光度（A）值，以試劑盒提供的標準品測定結果繪制標準曲線，計算細胞因子的含量。

1.3 統計學處理 應用SPSS11.5統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 兩組血漿中細胞因子水平的比較 T2DM組患者IL-1和IL-18水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；IL-37水平略高于對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 兩組血漿中細胞因子水平的比較

2.2 兩組MDM NLRP3炎性體相關分子表達水平的比較 T2DM組患者NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），詳見表3。T2DM患者分離的MDM經葡萄糖刺激后細胞培養上清液中的TNF-α、IL-1β水平均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），詳見表4。

表4 兩組MDM經葡萄糖刺激產生細胞因子水平的比較

3 討論

T2DM發病機制目前尚不清楚，近年來隨著固有免疫研究的迅速進展，有關固有免疫細胞炎性體途徑介導的炎癥反應在自身免疫炎癥性疾病中的作用越來越受到關注。炎性體是由模式識別受體如NLR識別配體后與接頭蛋白ASC、半胱天冬酶-1等形成的大分子的復合物[11]，形成后能激活半胱天冬酶-1，活化的半胱天冬酶-1繼而通過酶切IL-1β和IL-18前體分子而生成具有生物學活性的IL-1β和IL-18，進而調節炎癥反應。NLRP3炎性體是研究較多的一種，由NLRP3、ASC和半胱天冬酶-1組成[5]。多種內源性刺激物[12]如葡萄糖、游離脂肪酸、尿酸鈉（MSU）結晶及胞質外ATP和外源性刺激物如細菌、病毒等成分能誘導NLPR3的活化，通過誘導促炎性細胞因子如IL-1β的產生，在如糖尿病[4，6-7]、動脈粥樣硬化[13-14]等免疫炎癥性疾病[15]中的作用日益受到重視。

近來研究發現固有免疫細胞如巨噬細胞、內皮細胞、枯否細胞吞噬游離脂肪酸（FFA）、葡萄糖后，可激活炎性體途徑，釋放炎癥因子如IL-1β、TNF-α等，在T2DM的發生、發展中起重要的作用[4，6-7]。本研究顯示，老年T2DM患者血漿中的IL-1β和IL-18水平顯著高于健康對照組，與文獻報道[7-8]相似，提示老年T2DM患者的可能存在慢性低度炎癥狀態。IL-37是新近發現的具有抗炎癥作用的細胞因子[16]，本研究結果顯示，老年T2DM患者血漿中IL-37水平略高于對照組，但無統計學差異，提示IL-37在T2DM炎癥的調節中可能起一定的作用。為進一步研究T2DM患者固有免疫細胞NLRP3炎性體相關分子的表達以及對葡萄糖刺激的敏感性，將外周血單個核細胞分離后進一步分化為MDM，采用實時熒光PCR檢測MDM中NLRP3、ASC、IL-1β mRNA表達，發現老年T2DM患者來源MDM的NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達顯著高于對照組，提示患者的炎性體易被激活。用一定濃度的葡萄糖刺激后發現T2DM患者MDM的TNF-α、IL-1β水平均顯著高于對照組，與文獻報道糖尿病患者NLRP3炎性體相關分子表達及葡萄糖能誘導NLRP3炎性體激活相一致[7]。以上結果提示由葡萄糖刺激引起的炎性體激活途徑可能在老年人T2DM的發生、發展中起重要的作用。

本研究發現老年T2DM患者血漿IL-1β和IL-18水平顯著高于對照組，并發現患者來源的MDM NLRP3炎性體相關分子的基因表達水平高于對照組，經葡萄糖刺激后IL-1β和TNF-α的水平顯著高于健康對照組，結果提示NLRP3炎性體活化途徑在老年人T2DM的發生、發展中起著一定的作用。近來研究發現炎性體活化途徑抑制劑在炎性體相關疾病的治療中取得較好的效果[18]，為進一步研制開發有效的T2DM藥物提供了一定的策略。

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Expression of NLRP3 inflammasome-related molecules in elderly patients with type 2 diabetes mellitus

HONG Baojian,SU Liyun, LIANG Lijuan,et al.Department of Central Laboratory Medicine,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014，China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of NLRP3 inflammasome-related molecules in elderly patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM). Methods The plasma levels of IL-1β,IL-18 and IL-37 in 30 T2DM patients and 30 healthy controls were measured with ELISA;the expression of NLRP3,ASC and IL-1β in monocytes derived macrophages(MDM)were detected by real time PCR.The contents of IL-1β and TNF-α secreted by MDM treated by glucose were also analyzed. Results Plasma IL-1β and IL-18 levels in T2DM patients was significantly higher than those in healthy controls(P＜0.05),while IL-37 level was no significantly increased(P＞0.05).Expression of NLRP3,ASC and IL-1 in MDM and IL-1β,TNF-α secreted by MDM were significantly higher than those in controls(P＜0.05). Conclusion The NLRP3 inflammasome pathway may be involved in the inflammatory process of elderly patients with T2DM.

IL-1β T2DM NLRP3 InflammasomesTNF

2016-05-03）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2016KYB032）

310014 杭州，浙江省人民醫院檢驗中心（洪寶建、蘇麗韞、梁麗娟、朱月霞、徐芳）；浙江大學醫學院免疫學研究所（陳建忠）

陳建忠，E-mail：chenjianzhong@zju.edu.cn