低氧預處理BMSCs對大鼠AKI修復能力的影響及其機制研究

劉紅 丁小強 王華 陳洪宇 俞小芳

低氧預處理BMSCs對大鼠AKI修復能力的影響及其機制研究

劉紅 丁小強 王華 陳洪宇 俞小芳

目的 探討低氧預處理大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）移植對大鼠缺血-再灌注（I/R）急性腎損傷（AKI）的修復作用及其可能機制。方法 采用200μmol/L氯化鈷（CoCl2）低氧預處理大鼠BMSCs。夾閉雙側腎蒂40min建立大鼠I/R AKI模型，按隨機數字表法分為頸動脈注射細胞培養基組（control組）、常氧培養BMSCs移植組（normoxia+BMSCs組）及低氧預處理BMSCs移植組（Co+BMSCs組），每組24只。BMSCs移植再灌注后24、48、72h及1周時每組各處死大鼠6只，采用開胸心腔內采血方法采集血樣檢測血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）水平，取腎臟組織觀察形態學變化和腎小管間質損傷程度并評分；采用ELISA法和RT-PCR法檢測再灌注后24h大鼠腎臟組織中血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維母細胞生長因子（bFGF）、肝細胞生長因子（HGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的表達水平。 結果 (1)再灌注后24h，Co+BMSCs組、normoxia+BMSCs組大鼠BUN、Scr水平均低于control組（均P＜0.05），且Co+BMSCs組低于normoxia+BMSCs組（P＜0.05）；腎小管間質損傷程度以control組最重，normoxia+BMSCs組次之，Co+BMSCs組最輕；再灌注后48h，Co+BMSCs組大鼠腎小管上皮細胞修復最明顯，normoxia+BMSCs組次之；再灌注后1周，Co+BMSCs組大鼠BUN、Scr水平仍低于normoxia+BMSCs組和control組（均P＜0.05），normoxia+BMSCs組和control組出現了明顯的腎小管上皮細胞萎縮及間質纖維化等慢性改變，而Co+BMSCs組無此改變。（2）再灌注后24h，normoxia+BMSCs組大鼠 bFGF表達水平高于 control組（P＜0.05），而 Co+BMSCs組的 bFGF表達水平明顯高于normoxia+BMSCs組（P＜0.05）；normoxia+BMSCs組大鼠HGF表達水平高于control組，但差異無統計學意義（P＞0.05），而Co+BMSCs組的bFGF表達水平均高于normoxia+BMSCs組和control組（均P＜0.05）；3組大鼠VEGF和IGF-1表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。結論 與常氧培養BMSCs移植相比，低氧預處理后的BMSCs移植能更有效改善I/R大鼠腎功能、修復腎臟組織損傷，其作用機制可能與低氧預處理能更有效地促進BMSCs旁分泌HGF和bFGF等有關。

骨髓間充質干細胞 低氧 急性腎損傷 旁分泌

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是臨床常見的危重癥，發病率和病死率非常高。以血液凈化為主的治療措施雖使AKI的療效有了很大改進，但臨床上尚未發現能有效促進腎小管損傷修復的治療方法。骨髓間充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）不僅具有干細胞多向分化潛能、支持造血、調節免疫等功能，還具有低免疫源性、易于獲取、來源豐富等特點，被認為是最有希望能用于AKI臨床治療的首選干細胞[1]。但從動物實驗和早期的臨床試驗結果來看，BMSCs對腎臟損傷修復作用不盡如人意。目前體外擴增BMSCs大多在常氧條件下進行，而生理狀況下BMSCs在骨髓內的生長環境是低氧的，體外常氧培養可能導致BMSCs的遷移、分泌功能下降。本研究采用化學低氧劑氯化鈷（CoCl2）模擬低氧環境，研究低氧預處理后BMSCs移植對大鼠腎臟缺血-再灌注（ischemia repeffusion，I/R）AKI修復作用的影響，并探討低氧預處理后BMSCs旁分泌相關因子血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維母細胞生長因子（bFGF）、肝細胞生長因子（HGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的表達在其中的可能作用，從而為優化BMSCs移植治療AKI提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 100～130 g（細胞移植供體）及350～400 g（細胞移植受體）清潔級雄性SD大鼠（復旦大學上海醫學院實驗動物中心），LG-DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（美國GIBCO公司），CoCl2、VEGF檢測試劑盒、bFGF檢測試劑盒、HGF檢測試劑盒、IGF-1檢測試劑盒（武漢優爾生科技股份有限公司），Power SYBRR Green PCR Master Mix（日本TAKARA公司），引物合成（上海生物工程有限公司）。Transwell板（美國Corning公司），二氧化碳恒溫培養箱（美國Thermo Forma公司），倒置相差顯微鏡（美國Olympus公司），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），流式細胞儀（美國Beckman Coμlter公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養及鑒定 取100～130 g雄性SD大鼠為細胞供體，采用全骨髓貼壁法分離培養BMSCs，取P3代細胞采用流式細胞術鑒定其表面標志物，具體操作參考文獻[2]。

1.2.2 低氧預處理BMSCs 采用化學低氧劑CoCl2（濃度200 μmol/L）預處理大鼠BMSCs（培養24h），具體操作參考文獻[2]。

1.2.3 建立I/R AKI模型 4%戊巴比妥鈉（40mg/kg體重）腹腔注射麻醉大鼠，暴露腎臟，分離雙側腎蒂，無創傷動脈夾持續夾閉雙側腎蒂40min，夾閉5min后可觀察到腎臟明顯瘀血呈紫色，40min后恢復再灌注，可看到腎臟很快由紫黑色逐漸轉為鮮紅色，表明再灌注成功。

1.2.4 制備細胞懸液及細胞移植 將P3代細胞消化傳代后隨機分成常氧培養組（normoxia組）和低氧預處理組（Co組），消化洗滌后用不含FBS的LG-DMEM重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/ml。大鼠再灌注成功后即刻再次麻醉，結扎頸動脈遠心端，向頸動脈注入細胞懸液，注射完畢后結扎近心端。

1.2.5 動物實驗分組 將大鼠I/R AKI模型采用隨機數字表法分為3組，分別為頸動脈注射細胞培養基組（control組）、常氧培養BMSCs移植組（normoxia+BMSCs組）及低氧預處理BMSCs移植組（Co+BMSCs組），每組24只。各組大鼠移植成功后24、48、72h和1周時分別處死6只，采用開胸心腔內采血方法采集血樣5ml，分離血清，應用尿素酶-GLDH法檢測血清尿素氮（BUN）濃度，應用酶標法檢測血清肌酐（Scr）濃度，并取腎臟組織制備石蠟切片后行HE染色。

1.2.6 腎臟組織形態學觀察 采用盲法原則由病理科醫師在光鏡下觀察切片中腎臟組織的形態學變化，并進行腎小管間質損傷程度分級（采用Jablonski評分法）。每例切片200倍光鏡下隨機選取皮髓交界處10個不重疊視野，正常計0分，受損腎小管間質＜25%計1分，25%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分，以此作半定量分析計算其平均值，評分值越高代表損傷程度越重。

1.2.7 旁分泌相關因子及腎功能指標檢測 用雙抗體夾心ELISA方法檢測移植24h后I/R大鼠腎臟組織中VEGF、bFGF、HGF及IGF-1水平，操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.8 RT-PCR檢測旁分泌相關因子mRNA表達 按TAKARA試劑盒說明書用Trizol試劑提取移植24h后I/R大鼠腎臟組織總RNA。將總RNA用逆轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA。取1 μl進行20μl體系的RTPCR反應，反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃復制20s，72℃延伸30s，共40個循環。在PCR循環中，當熒光強度大于儀器軟件計算出的循環閾（Ct）值時，樣本被認為是陽性。利用檢測到的Ct值，以βactin mRNA為內參照，計算目的基因mRNA相對表達量。所有樣本重復測定3次。各基因上、下游引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.3 統計學處理 應用SPSS 18.0統計軟件；計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 3組I/R大鼠各時點BUN、Scr水平比較 見表2。

表2 3組I/R大鼠各時點BUN、Scr水平比較

由表2可見，3組I/R大鼠BUN和Scr水平均在24h時達到峰值。在24h及1周時，3組I/R大鼠BUN、Scr水平比較有統計學差異（均P＜0.05）；兩兩比較，24h時，Co+BMSCs組、normoxia+BMSCs組大鼠BUN、Scr水平均低于control組（均P＜0.05），且Co+BMSCs組大鼠BUN、Scr水平均低于normoxia+BMSCs組（P＜ 0.05）；1周時，Co+BMSCs組大鼠BUN、Scr水平仍均低于normoxia+BMSCs組和control組（均P＜0.05），而normoxia+BMSCs組與control組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。3組I/R大鼠48、72h時的BUN、Scr水平比較均無統計學差異（均P＞0.05）。

2.2 3組I/R大鼠各時點腎臟組織形態學比較 見圖1。

圖1 3組I/R大鼠各時點腎臟組織形態學比較（HE染色，×200）

由圖1可見，再灌注后24h，腎小管上皮細胞壞死、脫落、大量管型形成，以control組損傷最重，normoxia+ BMSCs組次之，Co+BMSCs組損傷最輕；再灌注48h后上皮細胞增生修復，其中Co+BMSCs組修復最明顯，normoxia+BMSCs組次之，control組修復最差；再灌注1周后control組和normixa+BMSCs組出現不同程度的慢性化改變，如腎小管上皮細胞萎縮、管腔擴張、間質炎癥細胞浸潤等，而Co+BMSCs組無明顯上述慢性化改變。

2.3 3組I/R大鼠各時點腎小管間質損傷程度評分比較 見表3。

表3 3組I/R大鼠各時點腎小管間質損傷程度評分比較（分）

由表3可見，再灌注后24h時，control組大鼠腎小管間質損傷程度評分高于normixa+BMSCs組及Co+BMSCs組（均P＜0.05），而Co+BMSCs組大鼠腎小管間質損傷程度評分低于normixa+BMSCs組（P＜0.05）；隨著時間的延長，各組大鼠腎小管間質損傷程度逐漸減輕，在48、72h及1周時，腎小管間質損傷程度評分仍以control組最高（均P＜0.05），Co+BMSCs組最低（均P＜0.05）。

2.4 3組 I/R大鼠再灌注后 24hVEGF、bFGF、HGF、IGF-1蛋白、mRNA表達水平比較 見表4。

表4 3組I/R大鼠再灌注后24hVEGF、bFGF、HGF、IGF-1蛋白、mRNA表達水平比較

由表4可見，再灌注后24h，Co+BMSCs組I/R大鼠bFGF和HGF蛋白、mRNA表達水平均高于normixa+ BMSCs組和control組（均P＜0.05），normixa+BMSCs組I/R大鼠bFGF蛋白、mRNA表達水平均高于control組（均P＜0.05）；3組I/R大鼠VEGF和IGF-1蛋白、mRNA表達水平比較均無統計學差異（均P＞0.05）。

3 討論

I/R是AKI常見病因，已有多項研究表明，在缺血性AKI動物模型中直接輸注BMSCs可以改善腎功能，促進腎臟修復。Herrera等[3]發現經尾靜脈注射BMSCs可以促進AKI大鼠的腎功能恢復，隨后Semedo等[4]動物實驗亦發現輸注BMSCs可以保護急性缺血性腎損傷，減少腎間質炎癥細胞浸潤，加速腎小管上皮細胞增生。但也有研究表明，單純的BMSCs在缺血微環境中存活和分化能力十分有限，da Silva等[5]研究發現直接輸注BMSCs治療AKI時，由于到達受損區域的細胞數量有限、細胞活力下降，導致治療效果甚微；Brunswig-Spickenheier等[6]研究表明BMSCs移植治療不能改善豬的I/ R損傷。因此，常規的BMSCs移植對AKI的治療作用仍然存在質疑。

事實上，由于腎臟發生I/R后受損區域內存在嚴重的缺氧、劇烈的氧化應激和炎癥反應，BMSCs對移植區域內的這一微環境變化非常敏感，極易發生細胞死亡從而直接影響BMSCs移植的治療效果。低氧預處理是目前發現的最強有力的內源性保護機制，通過預先短暫的低氧刺激啟動機體對隨后長時間缺氧損傷的保護反應。目前已有研究證實低氧預處理BMSCs移植可加速促進大鼠心肌梗死后心功能的恢復[7]。

本研究結果表明Co+BMSCs組I/R大鼠相較于normixa+BMSCs組，腎功能明顯改善，腎小管上皮細胞及間質損傷明顯減輕，損傷腎臟明顯修復，再灌注后24h時改善作用最為明顯，且在移植后1周時Co+BMSCs組I/R大鼠腎臟亦未出現腎小管上皮細胞萎縮等慢性化改變，說明與常氧培養BMSCs相比，低氧預處理BMSCs移植能夠明顯增強對急性損傷腎臟的保護作用。

目前關于移植BMSCs腎臟保護作用的機制尚未明確，有研究認為BMSCs可直接轉分化為腎小管上皮細胞參與損傷修復[3]，但目前這一研究結果仍存在較大爭議；更多的研究認為BMSCs到達受損區域后通過迅速旁分泌一系列細胞因子和生長因子減輕缺血區域內腎小管上皮細胞凋亡、促進其再生，即BMSCs的旁分泌作用[8]。BMSCs釋放的最常見的旁分泌相關細胞因子和生長因子包括HGF、VEGF、bFGF、IGF-1、基質源因子-1 （SDF-1）、轉化生長因子-β（TGF-β）、IL-6、血管生成素-1（Ang-1）及血小板起源的生長因子（PDGF）和粒細胞集落刺激因子（GCSF）等[9]。目前多數研究認為，在AKI腎小管修復過程中，移植的BMSCs在局部炎癥細胞和因子的刺激下分泌上述細胞因子，這些細胞因子通過旁分泌作用的方式下調損傷腎臟局部CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等多種促炎細胞數量，而上調調節性T細胞等抗炎細胞數量，并降低局部促炎因子表達，進而抑制AKI相關炎癥反應，促進腎功能恢復[10]。而在AKI病程早期，此時BMSCs尚不可能分化為腎小管上皮細胞，旁分泌功能被認為是其早期腎臟保護作用的主要機制。Togel等[11]研究發現BMSCs移植治療腎臟I/R后24h時，受損腎臟組織中高表達一些抗炎遞質和腎臟保護因子如IL-10、bFGF、TGF和IGF-1，從而證實旁分泌作用在急性缺血性腎損傷修復中起到主要作用。在眾多細胞因子中，bFGF、HGF具有促使新生血管重建、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等作用[11]，VEGF是重要的促血管生成因子，可促進內皮細胞增殖，延緩細胞凋亡、減輕炎癥反應[12]，IGF-1能夠促進細胞有絲分裂，加速細胞分化、增殖，提高細胞成熟速度[13]。

本研究檢測了再灌注后24h I/R大鼠腎臟組織中VEGF、bFGF、HGF和IGF-1的表達水平，結果顯示低氧預處理BMSCs可明顯促進bFGF和HGF的表達，從而增強BMSCs旁分泌作用，促進損傷腎臟組織修復。但本研究中Co+BMSCs組I/R大鼠相較于normixa+BMSCs組VEGF和IGF-1的表達水平無統計學差異，考慮化學低氧預處理的干預可能未達到兩者的有效低氧濃度，其機制仍需進一步研究。

綜上所述，本研究結果顯示低氧預處理BMSCs移植能夠更好地減輕I/R大鼠腎損傷，促進損傷腎臟修復，其作用機制可能與低氧預處理促進BMSCs旁分泌相關因子bFGF和HGF的表達有關。低氧預處理BMSCs移植也許是一種有前景的AKI細胞治療方法。

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Effects of hypoxia-preconditioning of bone marrow derived mesenchymal stem cells on rat acute kidney injury

LIU Hong,DING Xiaoqiang,WANG Hua,et al.Department of Nephrology，Hangzhou Hospital of TCM，Hangzhou310007，China

【 Abstract】 Objective To investigate the effects and mechanism of hypoxia-preconditioning of bone marrow derived mesenchymal stem cells(BMSCs)on acute ischemia/reperfusion(I/R)injury of rat kidney.Methods Hypoxia-preconditioning was performed on BMSCs by treatment with 200μmol/L CoCl2for 24h.I/R model was induced by cross-clasped for 40min followed by reperfusion in 72 SD rats and the animals were divided into 3 groups with 24 in each group.Rats in control group received carotid injection of cell culture medium,rats in normoxic BMSCs group received carotid injection of normoxia-cultured BMSCs and rats in hypoxic BMSCs group received carotid injection of hypoxia-preconditioned BMSCs.The renal function was estimated by measurement of serum creatinine(Scr)and blood urea nitrogen(BUN),and histological changes were observed by hematoxylin and eosin(HE)staining at 24h,48h,72h and 1wk after injection.The protein and mRNA expressions of VEGF,bFGF,HGF and IGF-1 in kidney were detected by ELISA and real-time PCR,respectively. Results At 24h after reperfusion,the BUN and Scr levels in both two BMSCs groups were significantly lower than those in control group(P＜0.05),and the levels in hypoxic BMSCs group was even lower than those in normoxic BMSCs group(P＜0.05),the renal tubulointerstitial damage of hypoxic BMSCs group was significantly lower than that of the normoxic BMSCs group and the control group(P＜0.05).at 48h after reperfusion,the renal tubular epithelial cells of the hypoxic BMSCs group recovered earlier than other two groups at 1 week after reperfusion,the BUN and Scr levels of hypoxic BMSCs group was still significantly lower than those of other two groups(P＜0.05),and there were nochronic changes in the hypoxic BMSCs group.The protein and mRNA levels of HGF and bFGF of hypoxic BMSCs group were significantly higher than those of the other two groups(P＜0.05),and the levels of HGF and bFGF in normoxic BMSCs group was higher than those in the control group. Conclusion Infusion of hypoxia-preconditioned BMSCs can enhance the recovery of IR injure of rat kidney,which may be attributable to the up-regulation of paracrine factors of HGF and bFGF after hypoxia preconditioning in BMSCs.

Mesenchymalstem cells Hypoxia Acute kidney injury Paracrine

2015-12-15）

（本文編輯：李媚）

國家自然科學基金（81570600）；上海青年醫師培養資助計劃（20141089）；復旦大學附屬中山醫院優秀青年計劃(2015ZSYX QN23)

310007 杭州市中醫院腎內科（劉紅、王華、陳洪宇）；復旦大學附屬中山醫院腎內科（丁小強、俞小芳）

俞小芳，E-mail:yu.xiaofang@zs-hospital.sh.cn