依達拉奉減輕毒死蜱誘導的PC12細胞損傷

宋 英，壽麗蒙，陳曼婷

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

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依達拉奉減輕毒死蜱誘導的PC12細胞損傷

宋 英，壽麗蒙，陳曼婷

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

驗證毒死蜱對神經細胞的損傷作用，并探究依達拉奉對毒死蜱誘導PC12細胞損傷的保護作用及其機制.MTT法摸索毒死蜱最佳損傷濃度以及依達拉奉最佳保護濃度，設立正常空白對照組、毒死蜱損傷模型組和依達拉奉保護毒死蜱損傷組，倒置顯微鏡下觀察PC12細胞形態，Hocehst33342染色，熒光顯微鏡下觀察各組細胞凋亡情況，western-blot檢測各組全細胞Nrf-2蛋白表達變化情況.結果表明：MTT法確定最佳毒死蜱損傷濃度為200 μmol/L，依達拉奉最佳保護濃度為25 μmol/L；光學顯微鏡下觀察細胞形態，依達拉奉可減輕毒死蜱誘導的PC12細胞損傷；Hocehst33342染色顯示毒死蜱可誘導PC12凋亡，依達拉奉減輕了毒死蜱對PC12的損傷；western-blot結果顯示依達拉奉組全細胞Nrf-2蛋白表達明增加，多于正常組和毒死蜱損傷組，正常組和毒死蜱組表達量相近.毒死蜱對PC12細胞具有損傷作用，可誘導細胞凋亡；依達拉奉具有減輕毒死蜱對PC12細胞損傷作用的功能，其保護機制可能是通過Nrf-2作用的.

依達拉奉；毒死蜱；大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株；Nrf-2

有機磷農藥(Organophosphates，OPs)在我國是使用范圍最廣、使用量最大的一種殺蟲劑，早期主要包括敵敵畏、甲拌磷、對硫磷和甲胺磷等，多為高毒品種，對人、畜毒性很強，環境污染嚴重.2008年1月底，我國徹底停止了甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷和磷胺等5種高毒有機磷農藥的生產、流通和使用.毒死蜱(Chlorpyrifos，CPF)作為一種替代高毒農藥的高效、中毒殺蟲劑，已成為有機磷類殺蟲劑的主流產品，被廣泛應用.隨著應用范圍的擴大及使用量的增加，人們逐漸意識到毒死蜱的潛在危險性，其對生態環境的污染以及對人類健康的危害日益引起國內外學者的重視.Jeong Eun Lee等率先用人體神經祖細胞(Human neural precursor cells，hNPCs)模型證明毒死蜱可降低細胞活力，增加乳酸脫氫酶的釋放，誘導活性氧ROS的產生，具有細胞毒性，數據顯示毒死蜱很可能具有影響神經發育的作用[1].流行病學研究也發現有機磷農藥暴露與帕金森病(Parkinson’s diesase，PD)的發生有一定關聯.Slotkin等用分化的PC12細胞比較了毒死蜱、二嗪農(diazinon)、狄氏劑(dieldrin)和二價鎳(Ni2+)對帕金森病相關基因轉錄的影響，發現有機磷類農藥毒死蜱和二嗪農，雖然作用方式不同，但是都明顯地改變了帕金森病相關基因的表達，表明有機磷農藥的暴露是帕金森發病的潛在危險因素[2].

大量研究結果顯示活性氧或自由基在神經變性疾病的發生發展中發揮著重要作用.相對其他組織，大腦耗氧量高，抗氧化劑水平較低，且膜結構中含有更多可氧化的不飽和脂肪酸，更容易受到氧化損傷.在發育階段的大腦為了滿足生長需求，代謝加劇，但抗氧化劑儲備量卻仍處于發育階段的較低水平，氧化應激對其帶來的損傷作用遠遠高于成熟大腦[3].依達拉奉(Edaravone)作為一種強力自由基清除劑，可抑制氧化應激，延緩神經變性疾病的發生發展，具有腦保護作用，可作為潛在的神經變性疾病治療藥物.Xiong N等在魚藤酮誘導帕金森病大鼠模型中發現，依達拉奉可以抑制活性氧的產生、抑制促凋亡蛋白Bax的表達和上調囊泡單胺轉運體的表達等作用，減輕魚藤酮導致的全身僵硬，抑制中腦線粒體損傷和多巴胺神經元的退化，提示依達拉奉可能是帕金森病的潛在治療藥物[4].然而依達拉奉應用于臨床的可行性和確切作用機制還需要進一步的理論依據.環境中殘留的不至于引起急性中毒癥狀的有機磷，不易被人體察覺，常常被忽視，因此長期暴露于低水平有機磷環境的危害必須得到證實并加以控制.基于這一研究目的，用PC12細胞建立有機磷農藥毒死蜱損傷模型，研究依達拉奉對毒死蜱損傷的保護作用及其潛在機制，對長期暴露于低水平有機磷環境的危險性加以證明，并為依達拉奉的臨床廣泛應用提供理論參考.

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 試劑

依達拉奉(先聲藥業，南京)；毒死蜱(CPF，浙江新農化工股份有限公司)；二甲基亞砜DMSO(Sigma-aldrich，美國)；二苯基四氮唑溴鹽MTT(上海生物技術有限公司)；Hoechst33342(南京凱基生物科技發展有限公司)；DMEM高糖培養基(吉諾生物醫藥科技有限公司，杭州)；胎牛血清(四季青，杭州)；胰酶溶液-EDTA含酚紅(南京凱基生物科技發展有限公司)；PC 12 細胞(上海中科院細胞所).

2.1.2 儀器耗材

細胞培養瓶、96 孔板、離心管和培養皿(Nest，中國)；生物安全柜(ESCO，新加坡)；二氧化碳細胞培養箱(Thermo，美國)；電子天平(METTLER TOLEDO，美國)；倒置熒光顯微鏡(Nikon，日本)；酶標儀(BioTek，美國)；臺式高速離心機(Thermo，德國)；臺式高速冷凍離心機(HERMLE，Z36HK，德國)；電泳儀(Bio-red，美國)；化學發光成像系統(Bio-red，美國)；4 ℃冰箱(西門子，中國)；-20 ℃冰箱(中科美菱，中國)；-80 ℃冰箱(Thermo，美國).

2.2 毒死蜱對PC12細胞最佳損傷濃度摸索

將細胞以1×104的密度接種于96 孔板，每孔100 μL；6 h后加藥，棄去原培養液，毒死蜱溶解于DMSO，用培養液稀釋毒死蜱溶液，設立毒死蜱濃度梯度為50，100，150，200，250 μmol/L，DMSO終含量都為1%；作用24 h候之后，棄去含藥培養液，PBS清洗一遍，加入培養液100 μL，再加入MTT溶液10 μL(MTT質量濃度為5 mg/mL)，細胞培養箱放置3 h；3 h后吸去每孔中溶液，加入DMSO各150 μL，充分溶解結晶后使用酶標儀在490 nm波長下檢測吸光度，記錄OD值用于確定最佳損傷濃度.

2.3 依達拉奉對毒死蜱誘導PC12細胞損傷的最佳保護濃度摸索

以1×104的密度將細胞接種于96 孔板中，每孔100 μL.6 h候后加藥，用2.2節中確定的毒死蜱最佳損傷濃度建立損傷模型，設立空白組、毒死蜱損傷組和依達拉奉保護毒死蜱損傷組，其中依達拉奉保護損傷組設立依達拉奉濃度梯度為5，25，50，100，200 μmol/L，作用24 h候之后，棄去含藥培養液，PBS清洗一遍，加入培養液100 μL，再加入MTT溶液10 μL(MTT質量濃度為5 mg/mL)，細胞培養箱放置3 h；3 h后棄去每孔中溶液，加入DMSO各150 μL，充分溶解結晶后使用酶標儀在490 nm波長下檢測吸光度，記錄OD值用于確定依達拉奉最佳保護濃度.

2.4 倒置顯微鏡PC12細胞形態學觀察

將PC12細胞接種與6 孔板中，設立正常組、毒死蜱損傷組和依達拉奉保護毒死蜱損傷組，6 h后按照2.2節和2.3節中的最佳損傷濃度和最佳保護濃度給藥，給藥方式及操作步驟同2.3，作用24 h后，倒置顯微鏡下觀察各組PC12細胞形態.

2.5 Hoechst33342細胞核染色

以1×104的密度將細胞接種于96 孔板中，每孔100 μL，設立正常組、毒死蜱損傷組和依達拉奉保護毒死蜱損傷組，加藥作用24 h后加入終質量濃度為5 μg/mL的Hoechst33342進行染色，每孔30 μL，避光靜置15 min后，吸去Hoechst33342液體，加入PBS清洗一遍后每孔加入不含酚紅的DMEM培養基100 μL，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況.

2.6 Western blot檢測Nrf-2蛋白表達情況

2.6.1 細胞培養

將PC12細胞培養與培養皿中，設立正常組、損傷組和保護組，正常組為空白細胞組，損傷組給予毒死蜱最佳損傷濃度處理24 h，保護組給予相同毒死蜱濃度以及依達拉奉最佳保護濃度處理24 h.

2.6.2 全細胞蛋白提取

藥物處理24 h后，棄去原培養液，各組加入適量PBS清洗2 次，洗去剩余培養液，用細胞刮刀收集細胞，每個皿加入200 μL細胞裂解液(含PMSF，終濃度為1 mmol/L)，用槍吹打數次，使所有細胞充分接觸裂解液(以上都在冰上操作)，充分裂解后，4 ℃，12 000 g離心4 min，取上清，-80 ℃保存用于后續實驗.

2.6.3 蛋白質量濃度測定

一管蛋白標準品(20 mg BSA)中加入0.8 mL蛋白標準配制液，充分溶解后即為25 mg/mL的蛋白標準溶液；取適量上述25 mg/mL的蛋白標準溶液，使用PBS稀釋至0.5 mg/mL，即為最終標準品終質量濃度；V(BCA試劑A)∶V(BCA試劑B)=50∶1，按此比列充分混勻，備用；96 孔板中，將標準品0，1，2，4，8，12，16，20 μL分別加入96 孔板中；取適量體積的樣品加入96 孔板中，加入PBS使上述每個標準品孔和樣品孔最終體積都為20 μL；各孔加入BCA工作液200 μL后，放96 孔板于37 ℃，20～30 min；使用酶標儀在562 nm波長下測定吸光度，根據標準品曲線計算出樣品的蛋白質量濃度.

2.6.4 蛋白變性

由2.6.3節中檢測的各組蛋白質量濃度，使用雙蒸水將各組蛋白定量成同一質量濃度，取適量，分別加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)，體積比為V(蛋白樣品)∶V(上樣緩沖液)=4∶1，混勻后沸水中加熱3～5 min，充分變性蛋白，冷卻到室溫后，-80 ℃封口保存，用于后續實驗.

2.6.5 凝膠電泳

根據蛋白分子量配制10%分離膠和5%濃縮膠，制膠成功后，在加樣孔中上樣，同時加一組彩色預染蛋白作為之后蛋白分子量判斷條帶；100 V恒壓電泳，30 min后，調節電壓至150 V，直至溴酚蘭到達分離膠底部，停止電泳，取出整片膠，根據彩色預染蛋白條帶及Nrf-2蛋白分子量切膠.

2.6.6 轉膜

裁剪一張與凝膠大小形狀相符的硝酸纖維素膜，浸泡于轉移液中，轉移裝置中依次為正極板、海綿、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙、海綿和負極板，鋪好之后使用玻璃棒滾壓，趕盡凝膠與硝酸纖維素膜之間的氣泡，放入轉膜儀器中，300 mA電流，持續冰浴，90 min左右.

2.6.7 抗體孵育

取出硝酸纖維素膜，放入封閉液中；搖床上封閉2 h后，取出硝酸纖維素膜放入一抗中，搖床上室溫孵育0.5 h后置于4 ℃冰箱孵育過夜；一抗孵育結束后，取出，使用TBST清洗3次，搖床，每次10 min；清洗結束后把膜浸沒于二抗中，室溫搖床孵育2 h；二抗孵育結束后，使用TBST清洗3 次，搖床，每次10 min.

2.6.8 顯影

按V(A液)∶V(B液)=1∶1的比例配制ECL顯影液(使用前配制，盡量避光)，在化學發光成像儀樣品板上，事先鋪上一層保鮮膜，將2.6.7節中清洗結束的硝酸纖維素膜置于保鮮膜上，盡量確保膜在成像板正中間，在膜上以及膜的四周滴上適量剛配制的ECL顯影液，運行儀器，顯影.

2.7 統計方法

數據通過 GraphPad Prism 軟件(One-way ANOVA)分析，用mean±SD表示，設置在p<0.05水平時有統計學意義.

3 實驗結果

3.1 毒死蜱對PC12細胞損傷作用

按照2.2節的實驗步驟，設立毒死蜱濃度梯度50，100，150，200，250 μmol/L，作用于PC12細胞24 h之后，酶標儀490nm波長檢測吸光度記錄各組OD值.處理數據見圖1，圖1中，以空白對照組的MTT吸光度值為100%，用其余各組吸光度值與空白對照組的比例表示為細胞存活率，結果如圖1所示，隨著毒死蜱濃度的增加，細胞存活率下降，呈一定的負相關(R2=0.928 8)，表明毒死蜱對PC12細胞的損傷隨著濃度的增加損傷程度不斷增大.當毒死蜱濃度為200 μmol/L時，細胞存活率為63%，據此選擇毒死蜱濃度200 μmol/L作為最佳損傷濃度，用于建立后續損傷實驗模型.

圖1 不同濃度毒死蜱對PC12細胞的作用Fig.1 The effects of CPF on PC12 cells

3.2 依達拉奉對毒死蜱誘導PC12細胞損傷的保護作用

選取3.1節中毒死蜱最佳損傷濃度200 μmol/L，作為之后實驗中依達拉奉保護的損傷模型濃度，建立空白對照組、毒死蜱損傷模型組和依達拉奉保護毒死蜱損傷組，設立依達拉奉濃度梯度5，25，50，100，150 μmol/L，作用24 h后同樣使用酶標儀在490 nm波長下檢測吸光度值并記錄，處理數據得結果如圖2所示，以空白對照組的MTT吸光度值為100%，用其余各組吸光度值與空白對照組的比例表示為細胞存活率.依達拉奉對毒死蜱的損傷具有保護作用，圖2中所示當依達拉奉濃度為25 μmol/L時，細胞存活率最高，最接近空白對照組，選擇此濃度作為依達拉奉最佳保護濃度.

圖2 不同濃度依達拉奉對毒死蜱損傷PC12細胞的作用Fig.2 The effects of Edaravone on PC12 cells injured by CPF

3.3 PC12細胞形態學觀察

6 孔板中，設立正常組、毒死蜱損傷組和依達拉奉保護毒死蜱損傷組，加藥作用24 h候，在倒置顯微鏡下觀察PC12細胞形態.得各組細胞形態如圖3所示，圖3(a)為正常對照組細胞，細胞形態完整，突起生長正常；圖3(b)為毒死蜱損傷組，相較于正常組，細胞密度稀疏，細胞形態不完整，尤其是突起的生長，長度不及正常組，甚至消失；圖3(c)為依達拉奉保護毒死蜱損傷組，細胞形態接近正常組，突起生長狀況良好，較少見突起完全消失的細胞，細胞密度相比于損傷組有增加.可見，依達拉奉對毒死蜱誘導的PC12細胞損傷具有一定的保護作用，可減輕PC12的損傷.

圖3 依達拉奉對CPF誘導PC12損傷細胞形態變化的影響Fig.3 Effect of Edaravone on PC12 cells morphological changes induced by CPF

3.4 Hoechst33342染色觀察細胞凋亡

Hocehst33342染料可進入細胞膜，對細胞核進行染色，根據細胞膜的通透性進入多少最終顯示為細胞核染色熒光強弱不同，凋亡細胞細胞膜通透性強于正常細胞，所以進入細胞內的Hoechst33342染料多于正常組，細胞核染色呈亮藍色，藍色熒光強度強于正常組，根據熒光強度區別凋亡細胞和正常細胞.將細胞接種于96 孔板中，設立正常組，毒死蜱損傷組，依達拉奉保護毒死蜱損傷組，加藥作用24 h進行Hocehst33342染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況如圖4所示，圖4(a)為正常組，圖4(b)為毒死蜱損傷組，圖4(c)為依達拉奉保護組，比較之下，毒死蜱損傷組細胞核染色明顯呈亮藍色，細胞密度也與光學顯微鏡下觀察相符，較為稀疏，說明毒死蜱可損傷PC12細胞，誘導其凋亡；依達拉奉保護組染色與正常組相近，顯示依達拉奉在一定程度上減輕了毒死蜱對PC12的損傷作用.

圖4 Hocehst33342染色觀察各組細胞凋亡情況Fig.4 Cell apoptosis in different groups stained by Hocehst33342

3.5 Western blot檢測Nrf-2全細胞表達變化

設立正常組、毒死蜱損傷組和依達拉奉保護毒死蜱損傷組，提取蛋白后western-blot檢測蛋白表達情況.結果如圖5所示，依達拉奉組全細胞Nrf-2蛋白表達明顯多于正常組和毒死蜱組，而毒死蜱組該蛋白表達接近與正常組，結合與損傷組Nrf-2表達量的比較，推測依達拉奉減輕毒死蜱誘導的PC12細胞損傷作用機制可能是通過Nrf-2實現的.

圖5 Western blot檢測全細胞Nrf-2表達情況Fig.5 Western blot analysis Nrf-2 expression in whole cell level

4 討 論

Slotkin等首先用SD大鼠乳鼠比較了毒死蜱和二嗪農的神經發育毒性作用，雖然二者作用不完全相同，但是數據證實兩者都具有神經發育毒性，而兩者作用方式的不同也提示需要進一步的實驗研究來揭示有機磷農藥的作用機制[5-6].Roegge等研究發現新生鼠暴露于低濃度的毒死蜱和二嗪農，都可導致行為學的變化[7].Timofeeva等證實低濃度對硫磷可導致持續的行為變化[8-9]，再一次為長期低濃度暴露有機磷的危險性加以證明，有機磷類農藥作用機制急需明確.Slotkin等采用PC12細胞為體外模型，通過比較不同神經發育毒性劑毒死蜱、二嗪農和狄氏劑和二價鎳，試揭示這類膽堿酯酶依賴的神經發育毒性劑的作用機制[10]，Slotkin的研究也發現有機磷農藥毒死蜱可引起氧化應激，細胞丟失，并可改變神經分化[11-15].顧娟等通過小鼠及體外培養小鼠胚胎端腦細胞實驗發現低濃度毒死蜱可顯著引起端腦神經細胞凋亡，并對小鼠的空間記憶能力具有一定影響[16].

相關文獻報道，毒死蜱可引起神經細胞氧化應激，進而誘導細胞凋亡，而Nrf2(NF-E2-related factor 2)是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，正常條件下，Nrf-2以未活化狀態存在與細胞漿中，當細胞發生氧化應激時，Nrf-2活化進入細胞核，與相關的抗氧化反應元件ARE(Antioxidant response element)結合，啟動一系列抗氧化蛋白的轉錄表達.本文實驗結果表明：毒死蜱對PC12細胞有損傷作用，顯微鏡下顯示毒死蜱損傷組的細胞，細胞扁平，整體形態不完整，尤其表現在對突起的影響，毒死蜱損傷后多數PC12的突起生長不完整，長度明顯比正常組細胞細短，甚至出現不少細胞突起消失；Hocehst33342染色也顯示毒死蜱損傷組細胞多數凋亡，結合western blot檢測Nrf-2蛋白表達結果，毒死蜱可損傷PC12細胞，誘導細胞凋亡；給予依達拉奉處理后，光鏡下細胞形態學的觀察、Hocehst33342染色凋亡情況及western-blot蛋白表達結果一致顯示，依達拉奉可減輕毒死蜱對PC12細胞的損傷作用，Nrf-2蛋白含量較損傷組明顯增多，一定程度上加速了抗氧化進程，緩解了細胞氧化應激，減少了毒死蜱引起的PC12細胞凋亡，其保護作用據實驗結果推測由上調Nrf-2蛋白表達量實現，而具體的機制，仍需進一步實驗證明.

5 結 論

毒死蜱對PC12細胞具有損傷作用，可導致PC12細胞氧化應激，誘導細胞凋亡；依達拉奉具有減輕毒死蜱誘導的PC12細胞損傷作用，其保護機制與上調Nrf-2蛋白表達量有關.

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[16] 顧娟.低濃度毒死蜱對小鼠胚胎端腦細胞體外培養及遠期空間記憶的影響[D].杭州:浙江工業大學,2012.

(責任編輯：陳石平)

Edaravone protects PC12 cells from CPF-induced damage

SONG Ying, SHOU Limeng, CHEN Manting

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 31014, China)

To evaluate both the damage of chlorpyrifos to PC12 cells and the effect of edaravone on protecting PC12 cells from chlorpyrifos-induced damage, as well as to uncover its possible protective mechanism, MTT method was used to determine the most appropriate concentration of CPF and to evaluate effects of different concentrations of protecting group, we perform a trial pilot study for the control group, the model group injured by CPF and the protecting group treated with CPF and edaravone, using a fluorescent inverted microscope to observe the cell mophology of all groups. Cell apoptosis in different groups were observed by Hocehst33342 stain and the western blot was used to detect the expressions of Nrf-2 in different groups. MTT find out that the most appropriate concentration of CPF is 200 μmol/L, and the most appropriate concentration of edaravone is 25 μmol/L. The cell mophology observation and the Hocehst33342 stain show that CPF can injury PC12 cells and lead to cell apoptosis, the administration of edaravone has a protective effect on the PC12 damage induced by CPF. The increasing expression of Nrf-2 in protecting group is more obviously than both control group and model group shown by western blot, while that of Nrf-2 in model group is similar to that in control group. CPF can cause PC12 injury and lead to cell apoptosis, edaravone can protect PC12 cells from damage induced by CPF, its proper mechanism maybe related to the expression of Nrf-2.

edaravone; chlorpyrifos; PC12; Nrf-2

2016-03-13

浙江省自然科學基金資助項目(LY17H090018)；全國臨床藥學研究基金資助項目(L2011079)

宋 英(1968—)，女，浙江紹興人，副教授，研究方向為神經藥理學，E-mail： songying@zjut.edu.cn.

R965

A

1006-4303(2016)06-0654-06