STAT3在Aβ寡聚體誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥反應中的作用

郭秀美， 張啟芳， 官志忠，

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STAT3在Aβ寡聚體誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥反應中的作用

郭秀美1， 張啟芳2， 官志忠1，2

目的 研究β-淀粉樣蛋白(Aβ)誘導小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應中信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)的表達水平及作用。方法 用蛋白印跡法檢測STAT3在Aβ寡聚體誘導的BV2小膠質(zhì)細胞炎癥反應中的表達水平；用siRNA沉默STAT3的表達后，實驗分為正常對照組、siRNA STAT3組、Aβ處理組、Control siRNA+ Aβ 組以及siRNA STAT3+ Aβ組，用實時熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IL1-β、TNF-α mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果 Aβ寡聚體處理小膠質(zhì)細胞后p-STAT3的表達水平增高，與Aβ寡聚體的濃度和處理時間有關(guān)。siRNA沉默STAT3使其mRNA和蛋白表達分別下降約67%和65%；與正常對照組相比，Aβ處理組的IL1-β及TNF-α mRNA和蛋白的表達水平增高；與Aβ處理組相比，siRNA STAT3+ Aβ組的IL1-β 及TNF-α mRNA和蛋白的表達水平降低。結(jié)論 STAT3參與調(diào)控Aβ寡聚體誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥反應中炎癥因子的釋放，在阿爾茨海默氏病(AD)的Aβ 作用機制中可能有一定的作用。

STAT3； 阿爾茨海默氏病； β淀粉樣蛋白； 小膠質(zhì)細胞； 炎癥反應

小膠質(zhì)細胞是大腦中具有高活性吞噬作用的巨噬細胞，在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的炎癥反應中起著重要作用[1]。在AD腦組織老年斑周圍存在小膠質(zhì)細胞的活化和聚集，其釋放的炎癥因子會對神經(jīng)細胞和突觸產(chǎn)生毒性作用。持續(xù)活化的小膠質(zhì)細胞引起的慢性炎癥反應是AD發(fā)病的主要病理機制之一[2]。

Janus酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子蛋白(Janus kinase- signal transducer and activator of transcription，JAK- STAT)是近年來細胞信號轉(zhuǎn)導通路的研究熱點。其中，信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)是該通路中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，被證明參與了AD發(fā)病過程中小膠質(zhì)細胞活化引起的慢性炎癥反應，介導多種炎癥因子的信號轉(zhuǎn)導[3]。

本實驗在體外用Aβ寡聚體誘導小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應，應用RNA干擾技術(shù)，探討STAT3在Aβ誘導的AD炎癥反應中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料 BV-2小鼠小膠質(zhì)細胞購自中國科學院昆明細胞庫。實驗中的主要材料和試劑有DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，美國)；0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素(Hyclone公司，美國)；細胞計數(shù)試劑盒CCK-8(Dojindo公司，日本)；Aβ1-42肽、六氟異丙醇、二甲基亞砜DMSO(Sigma公司，美國)；小鼠抗 Aβ 單克隆抗體6E10(Biolegend公司，美國)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、兔抗STAT3單抗隆抗體、STAT3 siRNA及沉默相關(guān)試劑(Santa Cruz公司，美國)；兔抗β-actin單克隆抗體(Abmart公司，美國)；兔抗p-STAT3多克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)；Trizol總RNA提取試劑、cDNA合成試劑盒(Takara，日本)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司，美國)；TNF-α、IL1-β ELISA 檢測試劑盒(eBioscience公司，美國)；聚乙烯二氟PVDF膜、ECL試劑盒(Millipore公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8方法測定Aβ1-42寡聚體的細胞毒性 在96孔板內(nèi)以每孔105個小膠質(zhì)細胞的密度接種，用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)長好后加入不同濃度的Aβ1-42寡聚體，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄液，每孔加入100 μl培養(yǎng)基+10 μl CCK-8試劑避光共同孵育，2 h后通過酶標儀測定450 nm處OD值。重復3次。

1.2.2 蛋白印跡法檢測p-STAT3、STAT3蛋白的表達 將裂解好的細胞懸液置于4 ℃冰凍離心機中12000 r/min離心15 min后取上清即為細胞總蛋白。用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法進行蛋白定量。用適量的細胞蛋白和上樣緩沖液混合后煮沸5 min再進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后采用半干法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，然后用封閉液將膜封閉2 h。之后加入p-STAT3(1∶1000)、STAT3(1∶500)、β-actin(1∶5000)一抗4 ℃ 孵育過夜，然后加入對應的二抗在搖床上搖1 h。每進行下一步時都要用TBST 清洗，最后用 ECL發(fā)光試劑觀察表達情況。

1.2.3 siRNA技術(shù)沉默小膠質(zhì)細胞中STAT3的表達及實驗分組 細胞按2×105密度接種6孔板，用無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞貼壁達60%～80%。取1 μg siRNA 雙鏈用 100 μl siRNA 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基稀釋制成溶液A，取6 μl siRNA 轉(zhuǎn)染試劑用 100 μl siRNA 轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基稀釋制成溶液B，溶液B加入溶液A輕輕混勻，置室溫孵育30 min。用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基漂洗細胞，AB混合液中加入0.8 ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，混勻后加到細胞中孵育，6 h后換用含胎牛血清和抗生素的正常培養(yǎng)基繼續(xù)孵育72 h。之后進行后續(xù)實驗，實驗分組如下：正常對照組、Aβ處理組、siRNA STAT3組、Control siRNA+Aβ組、siRNA STAT3+Aβ組。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測STAT3、IL1-β、TNF-αmRNA的表達水平 各實驗組的細胞用Trizol按試劑說明書完成RNA的提取，紫外分光光度計法定量后取總RNA 500 ng逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，終止；10 μl體系。將cDNA產(chǎn)物作為模板加入Real-time PCR反應體系按以下條件進行：預變性95 ℃，30 s；PCR反應95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；40循環(huán)，最后95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s終止，20 μl體系。引物序列：STAT3：Sense5’-TCGTGGAGCTGTTCAGTTCAGAAAC-3’，Antisence5’-GGAAATTTGACCAGCAACCT-3’；IL1-β：Sense5’-GGGCCTCAAAGGAAAGAATC-3’，Antisence5’- TACCAGTTGGGGAACTCTGC-3’；TNF-α：Sense5’- TATGGCTCAGGGTCCAACTC-3’，Antisence5’-TCC CTTTGCAGAACTCA GG-3’；β-actin：Sense5’- GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3’，Antisence5’- ATGCCACAGGATTCCATACC-3’。引物均由上海生工公司合成。應用2-ΔΔCT(RQ值)評價目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 各組小膠質(zhì)細胞經(jīng)處理后，取細胞上清液，用ELISA 檢測試劑盒測定IL1-β和TNF-α 的蛋白水平，按說明書步驟進行操作。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ寡聚體對細胞的毒性試驗 CCK-8試驗結(jié)果顯示，不同濃度的Aβ寡聚體對小膠質(zhì)細胞的毒性作用呈現(xiàn)劑量-效應關(guān)系。自0.5 μmol/L濃度起，寡聚體的毒性作用明顯；濃度為1 μmol/L時，BV2細胞的存活率下降約50%，與對照組相比，有顯著差異(P<0.01)，所以選擇1 μmol/L濃度的Aβ寡聚體處理BV2細胞(見圖1)。

*表示與對照組比較P<0.05；**表示與對照組比較P<0.01

圖2 BV2細胞免疫熒光染色(×100)

*表示與對照組比較P<0.05；**表示與對照組比較P<0.01

*表示與對照組比較P<0.05；**表示與對照組比較P<0.01

*表示與對照組比較P<0.05

*表示與對照組比較P<0.05

**表示與對照組比較P<0.01；##表示與Aβ處理組比較P<0.01

**表示與對照組比較P<0.01；##表示與Aβ處理組比較P<0.01

**表示與對照組比較P<0.01；##表示與Aβ處理組比較P<0.01

**表示與對照組比較P<0.01；##表示與Aβ處理組比較P<0.01

圖10 ELISA法測各處理組上清液中TNF-α蛋白的表達

2.2 Aβ寡聚體處理BV2細胞的免疫熒光染色 結(jié)果顯示與對照組相比，以6E10標記的Aβ寡聚體呈紅色，并且培養(yǎng)基中的Aβ寡聚體進入BV2細胞內(nèi)，以構(gòu)建AD細胞模型，見圖2。

2.3 蛋白印跡法檢測不同濃度Aβ寡聚體刺激BV2細胞STAT3蛋白表達 圖3顯示，與對照組相比，0.5 μmol/L Aβ寡聚體刺激BV2細胞可使p-STAT3蛋白表達水平增高(P<0.05)，1.0 μmol/L Aβ寡聚體處理使p-STAT3蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)；總STAT3蛋白表達水平?jīng)]有明顯改變。

2.4 蛋白印跡法檢測1.0 μmol/L Aβ寡聚體刺激BV2細胞不同時間的STAT3蛋白表達 圖4結(jié)果顯示，BV2細胞在Aβ寡聚體刺激下，STAT3在不同時間磷酸化程度有明顯改變，其中1 h的處理使 STAT3的磷酸化水平較其他時間明顯增高。

2.5 siRNA沉默STAT3在BV2細胞中的表達 圖5所示，siRNA沉默STAT3后，與對照組比較，STAT3 mRNA和蛋白的表達水平分別下降約67%和65%；圖6所示，siRNA沉默STAT3后，與對照組比較，p-STAT3與總STAT3蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。

2.6 siRNA沉默STAT3后，各處理組IL-1β和TNF-α表達情況 圖7～圖10結(jié)果顯示，Aβ處理組與對照組相比，IL-1β和TNF-α的mRNA及蛋白的表達水平均顯著增高；而siRNA沉默STAT3后再用Aβ寡聚體處理(即siSTAT3+Aβ組)與單純Aβ處理組相比，IL-1β和TNF-α的mRNA及蛋白的表達水平均明顯降低(P<0.01)。結(jié)果表明小膠質(zhì)細胞在Aβ寡聚體的刺激下會產(chǎn)生明顯的炎癥反應，釋放炎癥因子；而siRNA沉默STAT3后再用Aβ寡聚體刺激小膠質(zhì)細胞時炎癥反應明顯減弱。單純用siRNA沉默STAT3(未用Aβ寡聚體處理組)及轉(zhuǎn)染試劑對細胞炎癥反應未產(chǎn)生明顯影響。

3 討 論

AD是一種常見于老年人群的神經(jīng)退行性疾病，可導致認知功能障礙，記憶能力進行性減退。隨著人口老齡化的進程不斷加速，AD成為全世界日益嚴重的社會問題[4]。但其病因及發(fā)病機制仍不清楚。目前認為，Aβ沉積激活小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應是 AD 的發(fā)病機制之一[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞在Aβ沉積形成的腦組織老年斑周圍聚集并活化[6，7]。一方面，小膠質(zhì)細胞通過吞噬作用幫助清除Aβ，另一方面，小膠質(zhì)細胞也會釋放神經(jīng)毒性因子，主要包括IL-1、TNF-α和IL-6等加重炎癥反應[8～10]。已有研究證明用Aβ42 和Aβ40處理原代小膠質(zhì)細胞能引起其 IL-1β表達增高[11]；在 AD患者血清、 腦脊液及 Aβ 激活的小膠質(zhì)細胞中，IL-1β和TNF-α濃度均顯著升高[12]。本實驗用Aβ寡聚體刺激小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應，也得到同樣結(jié)果。小膠質(zhì)細胞釋放的這些炎癥因子反過來又會作用于神經(jīng)細胞和小膠質(zhì)細胞，并促進其他炎癥因子的產(chǎn)生[13]。因此，在Aβ沉積，激活的小膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞釋放的炎癥介質(zhì)之間形成了一個惡性循環(huán)，最終導致神經(jīng)細胞變性壞死。

有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ寡聚體可通過JNK、MAPK及NF-κB通路等途徑激活小膠質(zhì)細胞從而產(chǎn)生炎癥反應[14～17]。但是，Aβ 寡聚體誘導小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應的機制及與細胞信號傳導通路的關(guān)系尚不清楚。許多研究表明，STAT3參與Aβ寡聚體引起小膠質(zhì)細胞的慢性激活和炎癥因子的釋放[15，18]。STATs是近年來研究細胞信號傳導的熱點，STAT3是該家族中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，介導多種細胞因子向核內(nèi)傳導，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細胞的功能。STAT3被證明參與多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[19]，有研究表明STAT3在AD小鼠的腦組織中的表達增高，可能與AD的慢性炎性損傷有關(guān)[20]。

Huang等[21]研究表明用選擇性JAK抑制劑AG490阻斷下游信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子 STAT3 活化后，激活的小膠質(zhì)細胞釋放的炎癥因子TNF-α和NO的表達水平顯著降低。Paris等[22]研究發(fā)現(xiàn)用新煙草堿抗炎藥處理Tg /APPsw AD小鼠后，小鼠大腦中STAT3磷酸化水平以及炎癥因子TNF-a 和 IL-6的濃度均明顯降低。為了更直接明確Aβ寡聚體誘導的小膠質(zhì)細胞炎癥反應與STAT3之間的關(guān)系，本研究采用siRNA干擾技術(shù)沉默BV2 細胞中STAT3的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞釋放的炎癥因子的水平也隨之顯著降低。證明Aβ寡聚體誘導小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎癥反應可通過STAT3調(diào)控炎癥因子的釋放。提示STAT3與Aβ寡聚體介導的炎癥反應之間有密切的關(guān)系，可能參與了AD發(fā)病過程中Aβ的作用機制。

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The role of STAT3 in the inflammatory response of microglia induced by beta amyloid

GUO Xiumei，ZHANG Qifang，GUAN Zhizhong.

(The Department of Pathology of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China)

Objective To investigate the expression level and function of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in the inflammatory response of microglia induced by beta amyloid. Methods The expression level of STAT3 in the inflammatory responses of microglia induced by beta amyloid was detected by Western blotting；After the STAT3 was silent by siRNA，the experimental groups were divided into normal control，siRNA STAT3，Aβ group，Control siRNA+ Aβ，siRNA STAT3+ Aβ，then the mRNA and protein expression levels of IL1-β and TNF-α were measured by real-time fluorescence quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results The p-STAT3 expression increased in microglia treated with Aβ oligomers and was related to Aβ oligomers concentration and time. STAT3 siRNA marked its mRNA and protein expression decreased about 67% and 65% respectively；compared to the normal control group，the mRNA and protein expression levels of IL1-β and TNF-α of Aβ group increased；and compared to Aβ group，the mRNA and protein expression levels of IL1-β and TNF-α of siRNA STAT3+ Aβ group decreased. Conclusion STAT3 was involved in the regulation of the release of inflammatory cytokines in the inflammatory response of microglia induced by Aβ oligomers，playing a certain role in the pathogenesis of Aβ of Alzheimer’s disease(AD).

STAT3； Alzheimer’s disease； Beta amyloid ；Microglia； Inflammatory response

1003-2754(2016)11-0964-05

2016-09-25；

2016-10-16

國家自然科學基金(No. 81260173)；教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助”(No. IRT13058)；貴州省科技計劃{黔科合重大專項字[2014]6008號}；貴州省創(chuàng)新計劃項目{黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心[2014]06}

(1.貴州醫(yī)科大學病理學教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

官志忠，E-mail：1457658298@qq.com

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