骨髓間充質干細胞移植對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用

汪皖君， 管雅琳， 王雅靜， 于長申， 劉首峰， 呂鳳瓊， 王世民， 王新平

?

骨髓間充質干細胞移植對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用

汪皖君， 管雅琳， 王雅靜， 于長申， 劉首峰， 呂鳳瓊， 王世民， 王新平

目的 探討骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用，并探討其可能的機制。方法 經體外培養并純化BMSCs，移植前以10 mg/L的BrdU進行標記。線栓法制作大鼠MCAO模型，隨機分為移植A組、B組及對照C組。在模型建立后7 d，通過尾靜脈分別將3×106個BMSCs、1×106個BMSCs移植入A、B組大鼠體內，C組不作處理。于移植前、后分別進行改良神經損傷嚴重程度評分(mNSS)及Morris水迷宮測試，并取大鼠腦組織行免疫組織化學染色。結果 移植A組與移植B組、C組比較，行為學恢復更為明顯，(P<0.01)；B、C兩組相比無顯著性差異(P>0.05)；移植A組大鼠學習和記憶能力較C組明顯改善(P<0.05)。A、B組大鼠在腦損傷中心及周圍區，可見Brdu單染陽性細胞及Brdu + MAP-2、Brdu+ GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF雙染陽性細胞。結論 BMSCs經尾靜脈移植至MCAO大鼠體內后，可在大鼠體內存活、分化，并促進大鼠伸進功能恢復。療效與移植細胞數量相關。

骨髓間充質干細胞； 大腦中動脈栓； 尾靜脈； 大鼠； 細胞移植

腦梗死可導致多種神經系統后遺癥，是臨床上發病率及致殘率極高的血管性疾病[1]，目前藥物治療未達到突破性的效果[2]。BMSCs具有向星形膠質細胞、神經元、少突膠質細胞等多種組織系統分化的潛能[3]，并具備易于獲得、體外培養能快速擴增、可自體移植、能免疫耐受并能夠轉染和長期表達外源性基因等優勢。本試驗通過建立大鼠MCAO模型，進一步探討靜脈途徑移植BMSCs改善神經功能的機制，移植的有效劑量等問題。

1 材料和方法

本研究為隨機對照動物試驗，于2012年2月～2013年2月在天津市環湖醫院細胞室和天津市環湖醫院神經外科研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 5，-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)、鼠抗人5’-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)(MP MedBiochemicals公司)；兔抗人膠原纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體(北京中杉金橋)；兔抗人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)多克隆抗體(生物技術公司)；兔抗人腦源性神經生長因子(BDNF)多克隆抗體、Polymer雙染檢測試劑盒、兔抗人神經元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(武漢博士德公司)；Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物所制造)

1.1.2 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠4只，體重120～150 g，用于制備骨髓間充質干細胞。健康成年雄性SD大鼠120只，體重240～260 g，用于制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。大鼠均購于中國軍事醫學科學院實驗動物中心，動物質量合格證號：SCXK-(軍)-2012-004。實驗過程中對動物的處置符合2009年《 Ethical issues in animal experimentation》相關動物倫理學標準的條例。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養和標記 密度梯度離心法結合貼壁篩選法分離獲取BMSCs并在移植前1 d以BrdU標記，具體步驟見參考文獻[4]。

1.2.2 MCAO模型制作及分組 120只雄性SD大鼠均以體積分數10%水合氯醛按0.33～0.36 ml/100 g進行腹腔注射麻醉，使用改良Zea Longa’s線栓法阻斷左側大腦中動脈制作大腦中動脈閉塞(MCAO)局灶性腦缺血模型[5]，1 h后拔線栓再灌注。造模成功后7 d，納入實驗分組SD大鼠62只，隨機分為3組：移植A組(25只)、B組(25只)、對照C組(12只)。

BMSCs移植：在造模后7 d通過尾靜脈注射方法將含有約3×106個BMSCs的細胞懸液和1×106個BMSCs的細胞懸液各1 ml，分別經尾靜脈注射移植入A組、B組大鼠體內，注射后使用1 ml生理鹽水沖管[6]。C組自然恢復不做處理。移植后大鼠置于普通鼠籠中喂養，行清潔抗感染護理。

1.2.3 行為學評價 于大鼠移植前、移植后分別進行mNSS評分評估神經功能恢復情況；移植后用Morris水迷宮測試大鼠學習和記憶能力。由兩名熟悉mNSS評分、Morris水迷宮的非試驗人員獨立觀察記錄，最后取平均值。

1.2.4 組織學檢查 移植后7 d、14 d、30 d，在各組大鼠中均隨機選取4只模型鼠，以40 g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液心臟灌注固定，斷頭取腦后置于多聚甲醛磷酸鹽固定液中24 h以上。將腦組織制作常規石蠟切片，行蘇木精-伊紅染色及免疫組化染色。

1.2.5 主要觀察指標 于大鼠移植前、移植后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d進行mNSS評分；于移植后14 d、28 d進行Morris水迷宮訓練及測試；移植后7 d、14 d、30 d腦組織行免疫組化染色，觀察有無BrdU陽性細胞，Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF免疫組化雙染陽性細胞及單染陽性細胞。

2 結 果

2.1 實驗動物數量分析 實驗選用大鼠62只，分為3組，無脫失，全部進入結果分析。

2.2 各組大鼠mNSS評分 該評分越高，神經功能缺損越嚴重，術前所有大鼠評分均為0分，移植前及移植后3 d時3組大鼠的mNSS均增高，但沒有統計學差異(P>0.05)，隨后各組分值逐漸降低，A組分值明顯低于其它各組，差異有顯著性意義(7 d、14 d、21 d、28 dP<0.01)。B組、C組分值亦漸趨下降，取各組均數B組下降更明顯，但兩組差異無統計學意義(P>0.05)(見表1、圖1)。

2.3 Morris水迷宮評價結果

2.3.1 定位航行試驗 在大鼠移植后14 d，28 d定位航行試驗結果：A、B、C三組比較，A組逃避潛伏期顯著低于B、C兩組(P<0.05)，同時B、C兩組之間，逃避潛伏期無顯著差異(P>0.05)(見表2)。

2.3.2 空間探索試驗 在大鼠移植后14 d，28 d空間探索試驗結果：A、B、C三組比較，A組逃跨越平臺次數多于B、C兩組(P<0.05)，同時B、C兩組之間，跨越平臺次數無顯著差異(P>0.05)(見表3)。

2.4 組織學檢查結果

2.4.1 HE染色 本實驗為BMSCs異體移植，未使用免疫抑制劑，移植后1 m各組均未發現腫瘤細胞及異常分化細胞存在。三組大鼠腦組織HE染色均可見梗死區域：細胞壞死、神經纖維疏松、間質水腫，淋巴細胞、小膠質細胞吞噬壞死組織碎片形成的泡沫細胞及吞噬細胞，損傷區周邊可見膠質細胞增生及炎細胞浸潤，但腦室、海馬結構相對較完整。

2.4.2 免疫組化單染結果 C組未見到BrdU陽性的細胞。A、B組可見到BrdU陽性細胞散在分布于損傷側大腦半球的損傷中心區、脈絡叢、腦室管膜周圍及血管周圍處。BrdU是標記在培養的BMSCs胞核上，BrdU陽性證實移植的BMSCs可在宿主腦內存活(如圖2)。

2.4.3 免疫組織化學雙染結果 A、B組在損傷中心區、脈絡叢、腦室管膜周圍、血管周圍處可見Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+ vWF，Brdu+VEGF雙染陽性細胞，核呈紅色，胞漿呈棕色(見圖3)。

表1 各組大鼠神經功能損傷程度評分±s)

與模型組C相比*P<0.01；與模型組C相比☆P>0.05；與移植B組比較△P<0.01

表2 各組大鼠定位航行試驗比較±s)

與模型組C相比*P<0.05；與模型組C相比☆P>0.05；與移植B組比較△P<0.05

表3 各組大鼠空間探索試驗比較±s)

與模型組C相比*P<0.05；與模型組C相比☆P>0.05；與移植B組比較△P<0.05

圖1 腦損傷后不同時間點各實驗組mNSS變化曲線

圖2 BrdU×400

3 討 論

3.1 BMSCs經尾靜脈移植后可在MCAO大鼠體內存活、遷移并促進其神經功能恢復 本研究在移植組大鼠腦內可見Brdu陽性細胞。大鼠自體不含BrdU，本研究以Brdu標記BMSCs，在移植組大鼠腦內發現BrdU陽性細胞表明移植的BMSCs可在大鼠體內存活并向腦內遷移。

本研究以mNSS評分評估各組大鼠神經功能，評分越高，神經功能缺損越重。移植后3 d，三組大鼠mNSS評分均顯著下降，且各組間比較無顯著性差異，表明移植細胞在移植后3 d內尚不能充分發揮促進神經功能修復的作用。考慮可能與損傷早期腦內無菌性炎癥反應及腦水腫影響移植細胞的遷移、定植，以及移植細胞需逐漸通過自分泌及促分泌等發揮促進神經修復作用有關。移植第7 d，A組行為學評分顯著優于對照組，說明移植的BMSCs已經發揮神經修復作用。移植后30 d，A組行為學評分明顯優于C組，說明移植的BMSCs仍可在大鼠體內存活并持續發揮促進其神經功能缺損修復的作用。

本研究通過Morris水迷宮評估大鼠學習記憶能力。結果表明，與C組相比，A組大鼠訓練5 d后逃避潛伏期顯著縮短，幾乎可以快速找到平臺，目的較為明確，空間學習能力顯著優于C組，提示移植一定數量的BMSCs能改善MCAO大鼠的學習記憶功能。

本研究中，免疫組化結果顯示經尾靜脈途徑移植的BrdU+-BMSCs，分布于損傷側的缺血中心區、海馬、脈絡叢、室管膜周圍及血管周圍，表面移植的BMSCs可以在大鼠體內存活并向缺血周圍組織遷移。有研究[7]發現BMSCs在腦內存活和遷移的方式類似于大鼠星形膠質細胞，可以沿著室管膜下和胼胝體進行遷移。

本研究中，移植組大鼠腦內可見的Brdu+BDNF、Brdu+VEGF、BrdU+vWF雙染陽性細胞，表明移植的BMSCs不僅可在宿主腦內存活、遷移，并可分泌神經生長因子及促進內源性血管生長因子分泌[8，9]。亦有相關研究表明，移植的BMSCs可促進宿主內源性神經生長因子表達[10]，從而發揮腦缺血后的神經保護作用。

本研究表明移植BMSCs對于腦梗死的治療存在很大價值，尤其是可以改善神經功能缺損，與既往多個研究結果相同[11～13]。

3.2 BMSCs經尾靜脈移植后促進MCAO大鼠神經功能恢復的療效可能與移植數量相關 本研究中A組大鼠mNSS評分及學習記憶能力恢復顯著優于B組，表明細胞移植療效可能與移植的BMSCs的數量相關，移植細胞數量需達到一定閾值方可發揮促進神經修復作用。考慮與尾靜脈移植較立體定向移植等其他移植方式，距損傷中心相對較遠且需通過血腦屏障等，消耗相對較多，故移植數量在一定范圍內可顯著影響療效。

3.3 MCAO大鼠經尾靜脈移植BMSCs安全性評估 本研究未應用免疫抑制劑，在BMSCs同種異體移植后30 d，仍可見BMSCs存活于宿主體內，說明BMSCs免疫原性較低，可以與移植宿主較好的相容。與本研究類似，Scheibe等[14]在MCAO造模后6 h經靜脈途徑移植BMSCs至同種小鼠體內，之后用流式細胞技術觀察移植后的免疫反應，結果顯示炎性反應水平與對照組幾乎等同。

4 結 論

本研究證明，經尾靜脈途徑移植BMSCs至MCAO大鼠體內后，其可在大鼠體內存活、分化，并促進大鼠神經功能恢復，考慮機制可能與移植的BMSCs促進神經營養因子分泌有關。BMSCs的療效與數量有關，與1×106相比，3×106有較好的療效。同種異體移植BMSCs是安全的，整個實驗過程中未發現明顯免疫排斥反應及腫瘤形成。但本實驗觀察時間相對較短，其遠期效果及安全性等尚需進一步研究。

[1]Wessel MJ，Zimerman M，Hummel FC. Non-invasive brain stimulation：an interventional tool for enhancing behavioral training after stroke[J]. Front Hum Neurosci，2015，5(9)：265.

[2]Gomis M，Dávalos A. Recanalization and reperfusion therapies of acute ischemic stroke：what have we learned，what are the major research questions，and where are we headed[J]? Front Neurol，2014，11(5)：226.

[3]Peng T，Zhu G，Dong Y，et al. BMP4：a possible key factor in differentiation of auditory neuron-like cells from bone-derived mesenchymal stromal cells[J]. Clin Lab，2015，61(9)：1171-1178.

[4]Zhang J，Li Y，Zhang ZG，et al. Bone marrow stromal cells increase oligodendrogenesis after stroke[J]. Cereb Blood Flow Metab，2009，29(6)：1166-1174.

[5]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20：84-91.

[6]Yarygin KN，Kholodenko IV，Konieva AA，et al. Mechanisms of positive effects of transplantation of human placental mesenchymal stem cells on recovery of rats after experimental ischemic stroke[J]. Bull Exp Biol Med，2009，148(6)：862-868.

[7]Li Y，Hua XM，Hua F，et al. Are bone marrow regenerative cells ideal seed cells for the treatment of cerebral ischemia[J]? Neural Regen Res，2013，8(13)：1201-1209.

[8]Li N，Wang P，Ma XL，et al. Effect of bone marrow stromal cell transplantation on neurologic function and expression of VEGF in rats with focal cerebral ischemia[J]. Mol Med Rep，2014，10(5)：2299-2305.

[9]Bao X，Wei J，Feng M，et al. Transplantation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after cerebral ischemia in rats[J]. Brain Res，2011，1367：103-113.

[10]Shichinohe H，Ishihara T，Takahashi K，et al. Bone marrow stromal cells rescue ischemic brain by trophic effects and phenotypic change toward neural cells[J]. Neurorehabil Neural Repair，2015，29(1)：80-89.

[11]路 蔚. 骨髓間充質干細胞移植治療大鼠MCAO的實驗研究[D]. 天津醫科大學，2008：64.

[12]管雅琳，孔繁明，王世民，等. 骨髓間充質干細胞立體定向移植治療大鼠脊髓損傷[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(14)：2549-2555.

[13]劉慧純，張培培，王世民，等. 臍帶間充質干細胞移植治療大鼠腦缺血損傷[J]. 中國組織工程研究，2012，16(19)：3471-3475.

[14]Scheibe F，Ladhoff J，Huck J，et al. Immune effects of mesenchymal stromal cells in experimental stroke[J]. Cereb Blood Flow Metab，2012，32(8)：1578-1588.

a：Brdu+MAP-2×200 b：Brdu+GFAP×400 c：Brdu+vWF×200 d：Brdu+VEGF×400

圖3 腦損傷后14 d，2個移植組大鼠損傷處可見Brdu+MAP-2、Brdu+GFAP、Brdu+vWF、Brdu+VEGF雙染陽性細胞

Intravenous bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the treatment of ischemia-reperfusion injury in rats

WANG Wanjun，GUAN Yalin，WANG Yajing，et al.

(Department of Neurological Rehabilitation of Tianjin Huanhu Hospital，Tianjin 300010，China)

Objective BMSCs were isolated in vitro and purified. Methods 10 mg/L BrdU was used for labeling before BMSCs transplantation. SD rats were used to establish the middle cerebral artery ischemia-reperfusion model with modified suture method. The models were randomly divided into transplantation group A、transplantation groupB and control groupC. 7 days after injury，rats in group A were given 3×106BMSCs，and in group B were given 1×106BMSCs. Rats in the model group were left intact. Results Aafter transplantation of the BMSCs，group A’s recovery of the neurological deficit is was more apparently than group C and group B (P<0.01). There was no significant difference between group B and group C (P>0.05). Double-staining cells of immunohistochemistry could be found at the center of damage and surrounding of it. BrdU+cells and Immunohistochemical double staining positive cells were seen in group A and group B. BMSCs transplanted through vena caudalis can could survive and differentiate in the host brain. Conclusion BMSCs transplanted through vena caudalis can survive and differentiate in the host brain damage region. BMSCs transplantation is able to improve the neural function of cerebral ischemia injured rats. The efficacy is related to the number of BMSCs.

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells； MCAO； Vena caudalis transplantation； SD rats； Cell transplantation

1003-2754(2016)11-1017-04

2016-07-10；

2016-10-21

天津市科學技術委員會資助項目(No. 11JCZDJC19400)；天津市衛生局立項課題(No. 09KZ41)

[天津市腦系科中心醫院(環湖醫院)神經康復科，天津 300010]

王新平，E-mail：wangxinpingtj@sina.com

R743

A