衰老的卵巢間質成纖維細胞對腫瘤細胞增殖、侵襲能力的影響

高雯 朱滔

衰老的卵巢間質成纖維細胞對腫瘤細胞增殖、侵襲能力的影響

高雯 朱滔

目的 探討衰老的卵巢間質成纖維細胞對卵巢癌細胞系SKOV3的增殖、侵襲能力的影響。方法 原代培養人卵巢正常成纖維細胞（NOF），在體外持續傳代誘導細胞衰老，用衰老相關的β半乳糖苷酶染色（SA-b-gal）試驗檢測細胞是否發生衰老。收集正常成纖維細胞的條件培養基（CMn）及衰老成纖維細胞的條件培養基（CMs）。用CMn和CMs分別處理SKOV3細胞，利用CCK8試劑盒、Transwell小室及三維培養試驗檢測細胞的增殖、侵襲能力的變化。結果 卵巢正常成纖維細胞在體外持續傳代會導致細胞復制性衰老，在SA-b-gal試驗中有明顯的深藍色沉淀產物。用CMs處理SKOV3細胞，CCK8試驗顯示細胞培養第5天的OD（2.067±0.058）高于CMn組（1.073±0.056）（t=21.19，P＜0.01)，表明細胞的增殖能力增強。Transwell試驗顯示CMs組穿透Matrigel膠的細胞數（235.00±29.68）個，較CMn組的（129.30±15.52）個明顯增多（t=5.47，P＜0.01）；三維培養中形成的克隆球CMs組較CMn組明顯增大、數量明顯增多（27.00±2.16 vs 11.67±2.50；t=8.04，P＜0.01)，向外侵襲能力增強。結論 衰老的卵巢間質成纖維細胞在體外培養中能促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力。

卵巢癌 衰老 間質成纖維細胞 三維培養

近年來，對腫瘤的研究熱點逐漸從腫瘤本身過度到腫瘤微環境，在腫瘤微環境中最主要的是基質細胞，而成纖維細胞是最重要的一種基質細胞[1]。癌相關成纖維細胞通過多種方式與腫瘤細胞相互作用，從而調節腫瘤發生、發展。在卵巢正常的微環境中，也存在著間質成纖維細胞，幼稚的基質可為上皮腫瘤形成提供一個抑制性的環境[2]。而隨著年齡的增長及炎癥因子的刺激，間質成纖維細胞會發生衰老[3]。本文旨在研究外源性衰老的間質成纖維細胞對卵巢癌細胞增殖、侵襲能力的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞系和培養基 組織標本來自本院婦瘤科2014年10至12月收治的早期宮頸癌切除卵巢的標本2例，經病理證實卵巢正常。標本獲取前均與患者簽署知情同意書，獲得本人許可。從組織標本成功分離到2株卵巢正常成纖維細胞（NOF），體外培養，狀態良好。人卵巢癌細胞株SKOV3購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）；培養基為含10%胎牛血清（購自美國Gibco公司）、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DEME（購自美國Gibco公司）。

1.2 方法

1.2.1 NOF的分離和培養 （1）細胞培養：取生長狀態良好的NOF細胞，用含10%FBS的DMEM基培養，48h后細胞匯合度約80%；（2）收集條件培養基；取培養第3代的NOF（NOF3）培養24h后，更換無血清培養基，繼續培養48h后收集培養基即為正常條件培養基（CMn）。取培養第10代的NOF（NOF10）培養24h后，更換無血清培養基，繼續培養48h后收集培養基即為衰老條件培養基（CMs）。收集的條件培養基，1 500r/min，離心10min,吸取上清液并用 0.22pm一次性濾器過濾，可立即使用，也可-80℃保存備用。

1.2.2 β-半乳糖苷酶染色（SA-b-gal） GENMED細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自上海杰美醫藥科技有限公司。在6孔板分別接種NOF3和NOF10，37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱培養過夜，第2天待細胞密度達到50%～60%時，按照β-半乳糖苷酶試劑盒的說明書進行染色，之后在顯微鏡下拍照。

1.2.3 CCK8實驗檢測細胞增殖能力 CCK8試劑盒購自日本Dojindo公司。分別使用CMn和CMs作用于SKOV3細胞。取2 500個/孔（100μl/孔）的濃度將處于對數期的細胞接種到96孔板，每孔設3個對照；待細胞貼壁后，加入10μl CCK8，溫育2h；用自動酶標儀在450nm波長處，測定各孔的吸光度值（用OD值來表示）。連測5d，最后取各樣本的平均值進行比較。根據OD值推測出活細胞的數目，進而了解細胞的增殖能力。

1.2.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力 8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室購自美國BD公司。先將Matrigel（50mg/L）膠和無血清DMEM培養基以1∶3比例進行混合。小室上室鋪100 μl混合好的Matrigel，37℃無菌保持過夜，確保Matrigel充分凝固。收集對數生長期的細胞，分別用CMn和CMs培養細胞，調整細胞濃度為1× 106/ml，每孔加100μl細胞懸液于上室，設3個重復孔，下室加入10%FBS的DMEM培養基600μl。在37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中溫育24h后取出小室，濾膜用4%甲醛固定20min。用棉簽小心擦去未侵襲的濾膜表面細胞，結晶紫染色，之后在顯微鏡下拍照，本實驗重復3次。根據穿過膜的細胞數檢測其侵襲能力。

1.2.5 體外三維培養法 包被：（1）用0.02mol/L乙酸稀釋Ⅰ型鼠尾膠原（購自美國BD公司）至50μg/ml；（2）在24孔板中每孔加入以上 300～500μl已稀釋好的Ⅰ型鼠尾膠原，室溫孵育1h；（3）將24孔板中的液體吸走，PBS清洗3次；（4）24孔板可以立即使用或無菌條件下晾干備用。接種細胞24孔板每孔最終接種250個細胞，先取2個試管（A、B），A中加入培養基和一定數目的細胞，B中加入培養基、Ⅰ型鼠尾膠原和NaOH（比例為5∶1∶0.0235）在冰上操作，A和B的比例為1∶1，在冰上混和A、B，混勻后加入到已包被好的24孔板中，每孔加入1ml，仔細操作不要有氣泡產生，然后放進37℃培養箱孵育。10d后，熒光倒置顯微鏡下觀察克隆的形態，拍照，并計數克隆數量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計數資料以表示，比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 卵巢NOF及衰老成纖維細胞形態表現 正常卵巢組織培養7d后見稀疏的NOF從組織塊周圍長出，約14d鋪滿瓶底，正常上皮細胞較少見。NOF3生長狀態良好，未見上皮細胞混雜生長（圖1a）。NOF在體外培養6～10代后逐漸進入復制性衰老（圖1b），表現為細胞表型改變，增殖能力喪失，但基本代謝過程仍能維持。與NOF3比較，NOF10體積增大、細胞扁平、胞核與核仁體積增加，胞質內顆粒明顯增多等。將成纖維細胞分為NOF3和NOF10，觀察細胞衰老情況，經過SA-b-gal染色后，NOF10有明顯的深藍色沉淀產物，體外持續傳代誘導了成纖維細胞的復制性衰老（圖2）。

2.2 不同培養基處理后對SKOV3細胞增殖能力的影響 細胞培養1、2、3、4、5d，CMs組OD值分別為：0.152±0.012、0.285±0.010、0.884±0.036、1.572±0.050、2.067±0.058；CMn組OD值分別為：0.149±0.007、0.250± 0.010、0.485±0.018、0.775±0.045、1.073±0.056（其中第5天兩組比較t=21.19，P＜0.01）。以每日OD值均數繪制各組細胞的生長曲線，結果顯示，CMs組SKOV3的增殖能力明顯高于CMn組（圖3）。

2.3 不同培養基處理后對SKOV3細胞侵襲能力的影響 CMs組及CMn組穿過膜的細胞數分別為：235.00±29.68和129.30±15.52（t=5.47，P＜0.01）。CMs處理后SKOV3細胞的侵襲能力明顯增強（圖4）。

圖1 普通顯微鏡下觀察正常成纖維細胞和衰老成纖維細胞形態（a：正常的卵巢成纖維細胞，b：衰老的卵巢成纖維細胞；×40）

圖2 熒光倒置顯微鏡下觀察SA-b-gal染色后正常成纖維細胞和衰老成纖維細胞形態（a：正常的卵巢成纖維細胞，b：衰老的卵巢成纖維細胞；×40）

圖3 CCK-8法檢測不同培養基處理后SKOV3細胞的增殖能力

圖4 Transwell小室檢測不同培養基處理后SKOV3細胞穿過膜到達下室的細胞形態和數量圖（×100）

2.4 三維培養中觀察不同培養基對SKOV3細胞的作用 CMs組和CMn組形成的克隆球數量分別為27.00± 2.16和11.67±2.50（t=8.04，P＜0.01）。與CMn組比較，CMs組形成的克隆球明顯增大（圖5），數量增多。

圖5 三維培養觀察不同培養基處理后SKOV3的克隆球形態（×100）

3 討論

20世紀60年代初，美國科學家Leonard Hayflick在體外培養細胞時發現了一種特殊的細胞生命活動狀態，并將其命名為細胞衰老[5]。最初衰老被認為能阻止癌細胞的增殖潛能，從而在對抗癌癥中發揮重要作用，近來研究認為衰老還能促進腫瘤的發生、發展[6]。越來越多的證據表明：細胞衰老不僅僅是簡單的細胞生長中止現象，此外細胞衰老還涉及腫瘤抑制、腫瘤進展、組織修復及炎癥反應等復雜的生理活動[7]。細胞衰老分為三大類：復制性衰老、癌基因誘導的衰老和應激因素誘導的衰老。復制性衰老是指體外連續培養的細胞在有限次數的細胞分裂后，喪失合成DNA及分裂的能力，最后導致增殖能力的喪失，但基本代謝過程仍能維持[8]。衰老細胞進入一種既不同于靜止又不同于終末分化的獨特的生存狀態。此時衰老的成纖維細胞可使一種分泌型蛋白譜表達增加，并將其定義為衰老相關分泌因子或SASP[9]。通過cDNA微點陣分析，Bavik等[10]發現SASP由大量的旁分泌介質組成，如Gro-1、IL-8和MMP2等，這些介質在衰老的間質成纖維細胞中與未衰老的成纖維細胞相比呈過度表達狀態。且這些因子又可以反過來促進細胞的衰老。

本研究對人體正常卵巢組織中分離的NOF進行了研究，通過持續傳代發現：正常卵巢成纖維細胞在傳代過程中逐漸進入衰老，最多傳10代。衰老的細胞衰老相關beta半乳糖苷酶活性上升[11]，表現為細胞有明顯的深藍色沉淀物。衰老成纖維分泌的條件培養基CMs對比于CMn明顯促進卵巢腫瘤SKOV3的增殖和侵襲能力，在體外二維和三維培養都得到了證實。這可能在一定程度上解釋了卵巢癌易腹腔播散種植的生物學特性。由于三維培養更接近于體內生長模式，形成類似體內組織的結構，可以動態觀察到腫瘤細胞的侵襲轉移狀況。相較于一維的細胞劃痕實驗及二維的Transwell實驗具有明顯的優勢[12-13]。三維培養模型中觀察到的克隆球對于體外研究腫瘤的增殖和侵襲轉移具有重要的價值。CMs促進卵巢腫瘤SKOV3的增殖和侵襲能力，可能是由于衰老相關的分泌表型（SASP）發揮的作用。SASP包含一系列的炎癥細胞因子和生長因子，這些因子相互作用，在局部形成復雜的炎癥網絡結構[9，14]。SASP還具有潛在的導致上皮間質轉化（EMT）的作用[15]，而EMT在惡性腫瘤的侵襲和轉移中都是至關重要的一步，最終促進卵巢癌侵襲轉移等惡性生物學行為。這將是我們下一步的研究內容。

[1]Mao Y,Keller E T,Garfield D H,et al.Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer[J].Cancer Metastasis Rev, 2013,32(1-2):303-315.

[2]Salameh T S,Le T T,Nichols M B,et al.An ex vivo co-culture model system to evaluate stromal-epithelial interactions in breast cancer[J].Int J Cancer,2013,132(2):288-296.

[3]SMarthandan S,Priebe S,Hemmerich P,et al.Long-term quiescent fibroblast cells transit into senescence[J].PLoS One,2014,9 (12):e115597.

[4]DePinho R A.The age of cancer[J].Nature,2000,408(6809):248-254.

[5]Hayflick L.The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains[J].Exp CellRes,1965,37:614-636.

[6]Campisi J.Cellular senescence:putting the paradoxes in perspective[J].Curr Opin Genet Dev,2011,21(1):107-112.

[7]Rodier F,Campisi J.Four faces of cellular senescence[J].J Cell Biol,2011,192(4):547-556.

[8]Wang M C,Oakley H D,Carr C E,et al.Gene pathways that delay Caenorhabditis elegans reproductive senescence[J].PLoS Genet, 2014,10(12):e1004752.

[9]Canino C,Mori F,Cambria A,et al.SASP mediates chemoresistanceand tumor-initiating-activity of mesotheliomacells[J]. Oncogene,2012,31(26):3148-3163.

[10]Ruhland M K,Loza A J,Capietto A H,et al.Stromal senescence establishes an immunosuppressive microenvironmentthat drives tumorigenesis[J].Nat Commun,2016,7:11762.

[11]Endt H,Sprung C N,Keller U,et al.Detailed analysis of DNA repair and senescence marker kinetics over the life span of a human fibroblast cellline[J].J GerontolABiolSciMed Sci,2011,66 (4):367-375.

[12]Frith J E,Thomson B,Genever P G.Dynamic three-dimensional culture methods enhancemesenchymalstem cellproperties and increase therapeutic potential[J].Tissue Eng Part C Methods, 2010,16(4):735-749.

[13]Charwat V,Schutze K,Holnthoner W,et al.Potentialand limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3Dcellcultures[J].J Biotechnol,2015,205:70-81.

[14]汪春年,吳曉英,呂輝,等.VEGF通過影響CXCR4的表達調節卵巢癌細胞侵襲性的研究[J].浙江醫學,2010,32(2):226-229.

[15]Laberge R M,Awad P,Campisi J,et al.Epithelial-mesenchymal transition induced by senescent fibroblasts[J].Cancer Microenviron,2012,5(1):39-44.

Senescent ovarian stromal fibroblasts promotes the proliferation and invasion ability of human ovarian cancer cells

GAO Wen，ZHU Tao.Department of Gynecological Oncology, Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou 310022,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of senescent ovarian stromal fibroblasts on tumor growth and invasive ability of human ovarian cancer cells. Methods Normal human ovarian fibroblasts(NOF)were primarily cultured and senescence was induced by replicative exhaustion.Senescence associated beta-galactosidase staining was used to detect cell senescence of normal ovarian fibroblasts after serial subcultivation.Normal stromal fibroblasts conditioned mediums(CMn)and senescent stromal fibroblasts conditioned mediums(CMs)were collected.Ovarian cancer SKOV3 cells were treated with CMn or CMs.The cell proliferation and invasion were measured by cell counting kit 8(CCK8)and Transwell assay and three-dimensional cell culture,respectively. Results Replicative senescence was induced in NOF after serial subcultivation.Beta-galactosidase staining showed blue granules within cytoplasm of the senescent ovarian stromal fibroblasts.CCK8 assay showed that the proliferation of SKOV3 cells in CMs group was markedly increased compared to CMn group (OD value:2.067±0.058 vs 1.073± 0.056,t=21.19,P＜0.01).Transwell assay that the migration and invasion of SKOV3 cells in CMs group were markedly increased compared with CMn group (235.00±29.68 vs 129.30±15.52,t=5.47,P＜0.01).Three-dimensional culture showed that the clone spheres of SKOV3 cells in CMs group were larger and more aggressive than those in CMn group;and the number of clone spheres in CMS group were significantly increased compared with CMn group(27.00±2.16 vs 11.67±2.50,t=8.04,P＜0.01). Conclusion Our results indicates that senescent ovarian stromal fibroblasts may enhance proliferation and invasion of human ovarian cancer cells.

Ovarian cancer Senescence Stromal fibroblasts Three-dimensional cell culture

2016-05-15）

（本文編輯：馬雯娜）

310022 杭州，浙江省腫瘤醫院婦瘤科