結直腸癌組織中Syndecan-1與EGFR表達及KRAS突變的關系

原少斐 朱林佳 鄭維鍔 張武 孫洪雨

結直腸癌組織中Syndecan-1與EGFR表達及KRAS突變的關系

原少斐 朱林佳 鄭維鍔 張武 孫洪雨

目的 探討結直腸癌患者中多配體蛋白聚糖-1（Syndecan-1)與表皮生長因子受體（EGFR）表達及鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS）突變的關系。方法 選擇原發性結直腸癌標本160例，結腸部腫瘤112例，直腸部腫瘤48例；病理類型為腺癌156例，其它病理類型4例。利用免疫組化法檢測組織標本中Syndecan-1和EGFR的表達情況，運用直接測序法檢測組織標本中KRAS基因外顯子2第12、第13位密碼子的突變狀態。采用Spearman相關分析Syndecan-1的表達與EGFR表達及KRAS基因突變的關系。結果 腫瘤標本中Syndecan-1表達陽性41例，主要位于細胞膜20例，主要位于細胞漿16例，細胞膜與細胞漿同時表達5例。EGFR在結直腸癌中的陽性表達率69.4%，所有結直腸癌患者中發生KRAS突變率為37.5%。Syndecan-1的表達在腫瘤區域淋巴結有無轉移、有無遠處轉移中差異均無統計學意義（均P＞0.05）。Syndecan-1的表達與EGFR表達呈顯著相關（r=1.488，P＜0.01），而與KRAS狀態無相關性（r=9.278，P＞0.05）。結論 Syndecan-1的表達可能對結直腸癌患者的進展及預后判斷有一定價值。

多配體蛋白聚糖-1 表皮生長因子受體 鼠類肉瘤病毒癌基因 結直腸癌

多配體蛋白聚糖-1（Syndecan-1）屬于整合素黏附分子跨膜硫酸蛋白多聚糖（HPSG）家族的成員，是一種表達于成熟上皮細胞、前B細胞及漿細胞表面的跨膜蛋白聚糖，分子量約85～92kD，可特異性結合一些有生物活性的小分子物質，主要參與調控細胞的生長、分化以及遷移等[1]。Syndecan-1能夠促進細胞之間的黏附，阻止細胞的侵襲和脫落，進而限制腫瘤細胞的惡性表型，在控制惡性腫瘤細胞生長和轉移等過程中有重要作用。Syndecan-1在一些上皮來源腫瘤或癌前病變組織中表達降低或缺失，可作為判斷腫瘤預后的指標[2-3]。KRAS是RAS癌基因家族成員，位于染色體12p12.1，在細胞生長以及血管生成等相關的信號轉導通路中起著重要調控作用，與腫瘤的發生、發展密切相關[4-5]。KRAS是EGFR信號通路下游的重要癌基因。有報道在結直腸癌中KRAS突變率在30%～40%[6]。最常見的突變發生在第2號外顯子的第12和13密碼子。大量臨床試驗證實Cetuximab或Panitumumab聯合治療野生型KRAS結直腸癌的有效率為41%～61%，而對KRAS突變者幾乎無效，因此KRAS突變被認為是抗EGFR單抗療效不佳的獨立預后因素[7-8]。本研究通過免疫組化法檢測Syndecan-1的表達，分析其與EGFR表達及KRAS突變的關系，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2009年6月至2014年12月本院腫瘤外科和胃腸外科手術切除的原發性結直腸癌標本160例，患者中男106例，女54例；年齡33～78（52.0±4.8）歲；腺癌156例，未分化癌2例，鱗癌1例，印戒細胞癌1例，其它病理類型4例；浸潤深度pT1～2期28例，pT3～4期132例；有淋巴結轉移112例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有標本采集前均與患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制作 構建2個8×8點陣的組織芯片，一個用于免疫組化染色，一個用于陰性對照。標本經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，厚度3μm連續切片。對制成芯片的所有組織進行點陣標記。根據標記，利用點陣儀對標記完成的組織進行打點取樣，黏附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。每例標本取1個點。烤片6 h，芯片制作完成。

1.2.2 免疫組化SP法 SP試劑盒購于北京中杉生物技術有限公司，鼠抗人Syndecan-1、EGFR單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。將待檢標本切片后經二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，3%H2O2作用15min，以阻斷內源性過氧化物酶活性；切片置10mmol/L檸檬酸緩沖液中微波加熱以修復抗原；冷卻后滴加山羊血清封閉液，室溫孵育15min，封閉非特異性抗體。去掉多余血清，加入一抗，4℃過夜。滴加生物素標記羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶一鏈霉菌卵白素工作液，室溫孵育各15min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，封片。陰性對照以PBS代替一抗。

1.2.3 免疫組化結果判斷 按半定量積分法判斷表達[9]，根據染色強度及陽性細胞所占比例分別記為0～3分。染色強度：未著色為0分，著色淺為1分，中度著色為2分，著色深為3分。陽性細胞百分率：高倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野計數100個細胞，計算平均陽性細胞百分率。陽性細胞數百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～49%為2分，≥50%為3分。兩項評分相加，0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++），（+）、（++）、（+++）均視為陽性。

1.2.4 KRAS突變檢測 樣本DNA的提取：選擇經HE染色證實存在癌組織并占60%以上的蠟塊，切取3張厚度為10μm組織，裝入1.5ml已消毒離心管，常規脫蠟處理后，加入蛋白酶K至終濃度1mg/ml，十二烷基硫酸鈉（SDS）至2%。孵育24～36h后，離心處理（15 000r/ min，15min，4℃）。抽取石蠟層下的液體。按照QIAamp DNA FFPF Kit試劑盒（德國Qiagen公司）步驟提取石蠟組織DNA，最后以30μl洗脫液洗脫DNA，DNA產物用紫外分光光度計檢測DNA濃度，調節到100μg/ml，-20℃保存備用。KRAS基因的PCR擴增及測序：根據文獻[10]，選擇擴增12/13號密碼子所需特異性引物，引物序列為：5′：AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA-3′（正義）；5′：CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′（反義）。PCR反應體系50μl，包含2μl模版DNA，10μmol/L正、反各1μl，25μl Premix（含1.5U TaKaKa Taq；10×PCR Buffer，3.0 mmol/L Mg2+；0.4 mmol/L dNTP Mix），引物及PremixPCR檢測試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR反應條件：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃40s，循環30次，循環結束4℃保持，PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統觀察和分析結果。選取PCR陽性DNA凝膠條帶作為目的片段，采用QIAquick PCR Purification Kit對PCR產物進行回收（Qiagen公司產品），后送至上海基因技術有限公司測序。1.3 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件，計數資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關。

2 結果

2.1 Syndecan-1表達 Syndecan-1表達陽性41例，陽性表達率為25.6%，陽性表達的腫瘤細胞細胞膜和細胞質可見棕黃色顆粒（插頁圖1-4）；其中Syndecan-1的表達主要位于細胞膜20例，主要位于細胞質16例，細胞膜與細胞質同時表達5例。

2.2 不同臨床病理特征中Syndecan-1表達情況 見表1。

由表1可見，Syndecan-1表達在腫瘤浸潤深度方面差異有統計學意義（P＜0.05），在患者性別、年齡、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移及腫瘤分化程度方面差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.3 EGFR表達 EGFR表達陽性111例，陽性表達率69.4%，主要表達于細胞膜，呈棕黃色細顆粒狀（插頁圖5-6）。

表1 不同臨床病理特征中Syndecan-1表達情況（例）

2.4 KRAS突變情況 發生KRAS突變60例，突變率為37.5%；其中13密碼子突變10例，均為G13D（10/ 60，16.7%）；12密碼子突變50例（50/60，83.3%），共檢出5種突變類型，G12D突變率最高（21/60，35.0%），其余依次為G12V（15/60，25.0%），G12A（11/60，18.3%），G12C（10/60，16.7%），G12S（3/60，5.0%）。

2.5 Syndecan-1與EGFR表達及KRAS突變的關系見表2。

表2 Syndecan-1與EGFR表達及KRAS突變的關系（例）

由表2可見，結直腸癌患者中Syndecan-1的表達與EGFR表達顯著相關（r=1.488，P＜0.01），而與KRAS基因是否突變無相關性（r=9.278，P＞0.05）。

3 討論

Syndecan-1是一種表達于成熟上皮細胞、漿細胞、前B細胞表面的跨膜蛋白聚糖，其硫酸乙酰肝素側鏈上可特異性地結合多種生物活性分子，與脂蛋白、病原體等胞吞吐作用有關。Syndecan-1的功能主要有：（1）隔離保護生長因子等免被蛋白酶降解，并協調其與相應受體的結合；（2）與細胞外基質（ECM）結合，增強細胞黏附；（3）以共受體的方式調節細胞與微環境之間的相互作用，參與血管形成、組織器官分化發育、組織再生等一系列生理過程的調節。Syndecan-1通過與其共價連接的硫酸肝素側鏈結合一系列的細胞外配體，介導細胞-ECM、細胞-細胞間黏附，被認為在調節細胞間聯合和生長因子信號傳遞中發揮了重要作用[11-12]。Syndecan-1的表達在維持正常上皮形態結構的完整性和穩定性、影響細胞遷移的同時還以共受體方式調控細胞增殖，參與腫瘤的發生、發展過程。在一些上皮來源的腫瘤或癌前病變，如頭頸部腫瘤、肺癌、乳腺癌及胃癌中，Syndecan-1的表達降低或缺失，并且與臨床預后相關[13]。有研究發現，Syndecan-1在細胞膜上的表達對維持正常腸道黏膜細胞的形態至關重要[14]；其在大腸腺瘤向大腸癌的轉化中表達缺失，導致細胞喪失生長抑制功能，使腫瘤細胞能大量增殖，并具有極強的侵襲活性。

本文研究結果顯示，Syndecan-1在正常結直腸黏膜組織和結直腸癌中均有陽性表達，主要分布在細胞膜和（或）細胞漿，陽性信號為棕黃色顆粒染色，結直腸癌標本組織中Syndecan-1陽性表達率僅為25.6%（41/160），低于正常黏膜的表達。Syndecan-1表達在患者不同年齡、性別、結直腸癌分化程度及是否淋巴結轉及遠處轉移差異均無統計學意義，但在腫瘤浸潤深度方面差異有統計學意義，在一定程度上說明Syndecan-1的表達在結直腸癌發生、發展的過程中逐漸缺失。有關Syndecan-1與結直腸癌臨床預后的關系，有學者報道Syndecan-1表達陰性的結直腸腫瘤患者臨床預后較差，生存時間短[15]。因本研究未涉及到隨訪，以后將重點隨訪這些患者的生存時間來明確Syndecan-1的表達與結直腸癌患者預后的相關性。

在全球范圍內，結直腸癌的發病率逐漸攀升，其發病率居世界第3位[16]。結直腸癌的治療一直是國內外學者研究的熱點。隨著靶向治療藥物表皮生長因子受體（epidermal growth factorreceptor，EGFR）抑制劑西妥昔單抗（cetuximab）和帕尼單抗（panitumumab）的問世，目前結直腸癌的治療進入精準醫學指導下的靶向個體化治療時代。EGFR是Ⅰ型受體酪氨酸激酶，是原癌基因ErbB-1的表達產物，在多種上皮來源的惡性腫瘤中過表達，當其與配體結合時，通過激活酪氨酸蛋白激酶途徑，可促進腫瘤細胞生長和遷移、腫瘤血管形成及抑制腫瘤細胞凋。Ras蛋白（包括KRAS和NRAS）過度表達是細胞增生的標志，RAS基因是EGFR信號轉導通路中一個重要的下游調控基因，其陽性表達是腫瘤發生的早期事件。KRAS可由基因突變、自身活化或在接受EGFR的信號后發生過表達，這種過表達被認為是包括大腸癌在內的很多上皮源性惡性腫瘤的發生機制[17]。研究顯示，西妥昔單抗治療的有效性受其下游基因RAS狀態的影響[18]。突變型的RAS基因無需EGFR接受信號，能夠自動活化該通路并啟動下游信號的轉導，因此只有野生型RAS基因的患者才對抗EGFR單克隆抗體的治療有效，而突變型的患者無效。國外文獻報道，EGFR在結直腸癌組織中的陽性率為60%～75%[19]。本研究中，EGFR在結直腸癌組織中的陽性表達率為69.4%，與國外的研究結果相符。本研究同時分析了Syndecan-1的表達與EGFR表達及KRAS基因的關系，發現結直腸癌患者中Syndecan-1的表達與EGFR表達顯著相關，而與KRAS基因是否突變無相關性。

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Expressions of Syndecan-1,EGFR and KRAS gene mutations in colorectal carcinoma

YUAN Shaofei,ZHU Linjia,ZHENG Wei'e,etal.Department of Medical Oncology,The Third Affiliated Hospital,Wenzhou Medical University,Rui'an 325200, China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Syndecan-1,EGFR and KRAS gene mutations in colorectal carcinoma. Methods The expressions of Syndecan-1 and EGFR were detected by immunohistochemistry in surgical specimens of 160 patients with primary colorectal carcinoma treated between 2009 and 2014 at our Hospital.DNA sequencing was used to detect mutations in KRAS(codons12,13 of exon2).The relationship between Syndecan-1 expression and various clinicopathologicalparameters and molecular markers was analyzed.Results There were 156(97.5%)cases ofadenocarcinomas, and 4(2.5%)cases of other pathological types.Syndecan-1 expression was identified in 41(25.6%)colorectal cancer cases, among which 20 showed predominantly membranous immunopositivity,16 showed a predominantly cytoplasmic staining,and 5 showed mixed membranous and cytoplasmic staining.The positive rate of EGFR expression was 69.4%,and KRAS mutations rate was 37.5%in 160 colorectal cancer cases.The expression of Syndecan-1 was significantly correlated with EGFR expression (r=1.488,P＜0.01),however,it was not correlated with KRAS mutations(r=9.278,P＞0.05),lymph node metastasis and distant metastasis(P＞0.05). Conclusion The expression profile of Syndecan-1 may be of clinical value in colorectal cancer and may help in identifying aggressive forms of colorectal carcinoma.

Syndecan-1 EGFR KRAS Colorectal carcinoma

2015-12-14）

（本文編輯：馬雯娜）

325200 溫州醫科大學附屬第三醫院腫瘤中心

朱林佳，E-mail：ysf1004@163.com