PDTC對驚厥持續狀態大鼠海馬細胞凋亡及TLR4、caspase-3表達的影響

周琴 張勤 李光乾 周素芽

●論 著

PDTC對驚厥持續狀態大鼠海馬細胞凋亡及TLR4、caspase-3表達的影響

周琴 張勤 李光乾 周素芽

目的 觀察大鼠驚厥持續狀態后海馬中Toll樣受體4（TLR4）、NF-κB和半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的動態表達及神經細胞凋亡的變化，探討吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC）對驚厥后腦損傷的可能保護機制。方法 將106只SD大鼠隨機分為0.9%氯化鈉組（A組）、SC組（B組）和PDTC組（C組），B組根據大鼠驚厥后處死時間（4、24、48和72h），分為B1～B4組，B組和C組大鼠驚厥持續狀態模型的制作采用氯化鋰-匹羅卡品法，C組在大鼠制模成功后，每天腹腔注射PDTC（100mg/kg）1次，連用3d，于驚厥后72h處死。電鏡觀察海馬超微結構改變；免疫組化法測定大鼠海馬NF-κB/p65的表達；RT-PCR法檢測海馬TLR4、caspase-3 mRNA表達的動態變化；TUNEL法檢測神經細胞凋亡數的變化。結果 B組大鼠海馬神經元超微結構損傷存在動態變化，72h內病變進行性加重；C組大鼠病理改變較B4組減輕。B1～B4組海馬神經元胞核內有不同程度NF-кB/p65的表達，且較A組明顯升高（P＜0.05或0.01）。C組較B4組NF-κB/p65表達明顯下降（P＜0.01）。B1～B4組TLR4、caspase-3 mRNA的表達量均高于A組（P＜0.05或0.01），且隨時間延長逐漸升高，72h達到高峰；C組TLR4、caspase-3 mRNA的表達較B4組明顯降低（P＜ 0.05）。B組在驚厥24h后海馬CA1區TUNEL陽性細胞數已明顯高于A組（P＜0.01），72h達高峰，而C組TUNEL陽性細胞數較B4組明顯下降（P＜0.01）。結論 驚厥持續狀態后大鼠海馬TLR4、NF-κB/p65和caspase-3的表達增強。NF-κB抑制劑PDTC可以下調TLR4和caspase-3的表達，并使神經細胞凋亡減輕；提示TLR4/NF-κB信號通路在驚厥后海馬細胞凋亡的發生、發展過程中起促進作用。

驚厥 凋亡 Toll樣受體4 NF-κB 半胱氨酸蛋白酶-3 吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of pirrolidine dithiocarbamate(PDTC)on expression of TLR4,NF-кB, caspase-3 and the change of neuron apoptosis in hippocampus of status convulsion rats. Methods One hundred and six male Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into control group(A),convulsion group(B)and PDTC group(C).then group B were randomly divided into four subset groups (B1-B4),which would be executed at 4h,24h,48h,72h after convulsion discontinued.Continuous epilepticus was induced by injecting lithium chloride and pilocarpine,and rats in group C were daily injected with 100mg/kg PDTC 30 min after convulsion discontinued for 3 days.The histopathological changes in hippocampus were observed with electron microscope,NF-κB/p65 protein was detected by immunohistochemistry(IHC),the expression of TLR4 and caspase-3 mRNAwas detected by RT-PCR.The neuron apoptosis was examined by TUNEL.Results Neuronal injury was observed in group B with electron microscope,and the change was increased gradually after seizure induced;neuronal injury in group C was milder than that in group B at 72h.IHC staining showed that more positive expression of NF-кB/p65 was observed in nuclei of hippocampal neurons in group B,compared with group A (P＜0.05),and the protein expression of NF-кB/p65 in group C was much lower than that in group B4(P＜0.01).The mRNA expression of TLR4 and caspase-3 in rat hippocampus of group B was significantly elevated than that in group A(P＜0.05);and the tendency was increased gradually reaching the peak at 72 h after seizure,and that in group C was much lower than that in B4 group(P＜0.01).The TUNEL positive cells in hippocampus CAlofgroup B were more than those ofgroup A at 24h after seizure(P＜0.01)reaching the peak at 72h;andthe TUNEL positive cells in group C were lower than those in B4 group(P＜0.01). Conclusion The expression of TLR4,NF-кB and caspase-3 increased after SC in rats.PDTC can down-regulate the expression of TLR4 and caspase-3 and inhibit neuronal apoptosis in hippocampus ofrats with pilocarpine-induced seizures.These results suggest that TLR4/NF-κB may have protective effect on the development ofthe hippocampus apoptosis caused by status convulsion.

有研究發現，持續驚厥發作后將導致以海馬區為主的選擇性腦損傷，而神經細胞的死亡分為壞死與凋亡，壞死是被動的突發性細胞腫脹與溶解過程，凋亡則屬于主動程序性細胞死亡[1]。因細胞凋亡可以被調控，故其在驚厥后腦損傷中的作用日益受到關注。研究表明，免疫炎癥反應參與了驚厥引起的腦損傷過程[2]，筆者之前研究發現，驚厥持續狀態后大鼠海馬Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）/NF-κB信號通路被激活，并促進了驚厥持續狀態后大鼠海馬的損傷[3]。現進一步研究在驚厥持續狀態大鼠海馬神經元凋亡中TLR4/NF-κB信號通路的可能作用。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠106只，體重180～220g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供。溴化甲基東莨菪堿（S8502）、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）（P8765）由美國Sigma公司提供，氯化鋰（K73036）、匹羅卡品（K80477）由美國Fluka公司提供。兔抗大鼠NF-κB/p65一抗（RAB-9034）為LAB VISION公司產品，即用型免疫組化二抗試劑盒（KIT-5004）、DAB顯色劑（DAB-0031）由福建邁新公司提供。RT-PCR試劑盒（DRR023A）為日本TaKaRa公司產品，TRI Reagent總RNA提取試劑盒（TR-118）購自美國MRI公司。TUNEL試劑盒（ZK-8005）由瑞士Roche公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制作 大鼠隨機分為0.9%氯化鈉組（A組，16只）、驚厥持續狀態組（B組）和PDTC組（C組，18只），其中B組根據大鼠驚厥后處死時間（4、24、48和72h）分為B1～B4組，每組18只，A組和C組于驚厥后72h處死。驚厥持續狀態模型制作方法如下：大鼠先予腹腔注射127mg/kg的氯化鋰，18h后予溴化甲基東莨菪堿1mg/kg，30min后予注射匹羅卡品45mg/ kg。大鼠驚厥程度按Racine分級標準分為6級：0級，無驚厥發作；Ⅰ級，面部抽動；Ⅱ級，節律性點頭；Ⅲ級，前肢陣攣抽搐；Ⅳ級，全身強直伴站立；Ⅴ級，全身強直陣攣。當大鼠驚厥時間達30min時予阿托品1mg/kg、10%水合氯醛400mg/kg腹腔注射。驚厥程度達Ⅳ級以上、持續達30min的為合格驚厥持續狀態大鼠模型。A組以等量的0.9%氯化鈉代替匹羅卡品，其余用藥同B組。C組在大鼠驚厥停止后30min，給予每天腹腔注射1次100mg/kg的PDTC，連用3d。

1.2.2 電鏡標本制作與觀察 每組中任選2只大鼠腦海馬組織，2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，作海馬CA1區半薄切片，600A超薄切片，日立H600透射電鏡觀察神經細胞超微結構變化。

1.2.3 免疫組化法測定海馬NF-κB/p65的表達 每組隨機取10張大鼠海馬組織的石蠟切片，采用免疫組化法檢測NF-κB/p65表達。隨機取5個高倍視野（×400），測定陽性部位的平均吸光度（A值），累積吸光度（IA值），同時測定NF-κB/p65的核陽性細胞百分比。

1.2.4 RT-PCR檢測大鼠海馬TLR4、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）mRNA表達 每組隨機取6只海馬標本，稱取50～100mg制作勻漿，逆轉錄反應按試劑盒說明書進行。用β-actin作為PCR反應的內參照，引物序列及反應條件：（1）β-actin：5′-CTACAATGCTGCGT GTGG-3′，5′-ATGGCTACGTACATGGCTGG-3′，產物長度138bp。（2）caspase-3：5′-CTGGACTGCGGTATTGAG-3′，5′-ACGG GATCTGTTTCTTTG-3′；94℃預變性3min后，94℃變性30s，59℃復性30s，72℃延伸1min，循環32次，72℃延伸5min終止，產物長度289bp。（3）TLR4：5′-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3′，5′-ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3′；94℃預變性3min后，94℃變性30s，59℃復性30s，72℃延伸1min，循環32次，72℃延伸5min終止，產物長度356bp。用SmartView分析產物光密度值。

1.2.5 TUNEL檢測海馬CA1區神經元凋亡 每組隨機取10只大鼠的切片，TUNEL法檢測海馬神經元凋亡細胞的表達。隨機取5個高倍視野（×400），取其平均值，統計TUNEL陽性細胞數。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。兩變量的相關性分析采用Pearson等級相關。

2 結果

2.1 電鏡觀察海馬CA1區超微結構 A組大鼠海馬CA1區核膜完整光滑，神經元結構清楚，線粒體，粗面內質網和游離核糖體豐富（圖1，見插頁）。B1組CA1區神經纖維間隙水腫，少量連接模糊。B2組神經元細胞間隙明顯擴張，核致密度增加，核膜皺縮曲折，內質網輕度擴張，線粒體明顯腫脹。B3和B4組，神經元出現凋亡樣改變：表現為細胞核及細胞質固縮，結構致密，但核膜完整，多數線粒體、高爾基體均出現擴張、空泡樣改變，呈“暗神經元樣”改變（圖2，見插頁）。C組與B4組相比，海馬水腫范圍減小，程度有所減輕；內質網和高爾基體仍輕度擴張；線粒體仍有腫脹，但空泡樣變性少見；神經元細胞仍可見核固縮，但無“暗神經元”改變（圖3，見插頁）。

2.2 各組大鼠海馬CA1區NF-κB/p65免疫組化結果及核陽性細胞的比較 A組海馬中NF-кB/p65主要表達于細胞質，細胞核無染色。B1～B4組與A組比較，均有不同程度的NF-κB核陽性細胞表達于神經元和少量膠質細胞中，差異有統計學意義（P＜0.05）；于驚厥4h后NF-κB/p65即出現核轉移，達峰于驚厥后72h（P＜0.01）；C組與B4組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），詳見表1、圖4-6（見插頁）。

表1 各組大鼠海馬CA1區NF-κB/p65免疫組化結果及核陽性細胞的比較

2.3 各組大鼠海馬TLR4、caspase-3 mRNA表達的比較 A組大鼠海馬僅表達極少量的TLR4 mRNA；B組隨觀察時間的延長，TLR4 mRNA的表達量逐漸增加，于驚厥后72h達到峰值，與A組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），與B4組比較，C組的TLR4 mRNA表達量明顯降低（P＜0.05）。caspase-3 mRNA在A組海馬僅有少量表達，B組隨觀察時間的延長caspase-3 mRNA的表達量進行性增加，于驚厥后72h達到峰值，與A組比較，均有明顯升高（P＜0.05），與B4組相比，C組caspase-3 mRNA的表達量明顯降低（P＜0.05），詳見表2、圖7-8。

表2 各組大鼠海馬TLR4、caspase-3mRNA表達的比較

圖7 各組大鼠海馬TLR4mRNA表達電泳圖

圖8 各組大鼠海馬caspase-3mRNA表達電泳圖

2.4 大鼠海馬CA1區TUNEL檢測結果 A組少量TUNEL陽性細胞表達于大鼠海馬CA1區。B組TUNEL陽性細胞數逐漸增加，于72h達到峰值，相較A組，有統計學差異（P＜0.01）。與B4組相比，C組TUNEL陽性細胞數明顯下降（P＜0.01），但仍較A組高（P＜0.01），詳見表3、圖9-11（見插頁）。

2.5 相關性分析 TLR4mRNA與NF-κB/p65、caspase-3mRNA的表達均呈正相關（r＝0.572、0.704，均P＜0.01）；TUNEL陽性細胞數與TLR4 mRNA、NF-κB/p65與caspase-3 mRNA的表達均呈正相關（r＝0.823、0.580、0.649，均P＜0.01）。

表3 各組大鼠海馬CA1區TUNEL陽性細胞數的比較（個/HP）

3 討論

驚厥持續狀態易引起海馬區為主的選擇性腦損傷，這種損傷包括神經細胞的壞死與凋亡，而細胞凋亡受到一系列程序性調控的影響，可通過早期加以干預而逆轉。因此，驚厥持續狀態后神經元凋亡的預防，對于減輕驚厥性腦損傷具有重要意義。

筆者發現在驚厥持續狀態后，大鼠海馬CA1區出現不同程度的神經元凋亡樣改變，且在驚厥后早期（4h）即可見到早期凋亡細胞，隨后逐步出現凋亡晚期改變，其病變程度隨觀察時間延長逐漸加重，至驚厥后72h可見“暗神經元”樣改變，提示大鼠在驚厥持續狀態后，雖然沒有再次出現驚厥發作，但腦內的神經損傷在驚厥持續狀態后的3d內仍呈現進一步加重過程。PDTC干預后能減輕驚厥后海馬組織的病理損傷，減少凋亡細胞的產生，與文獻報道相符[4]。

caspase是直接導致細胞凋亡的蛋白酶系統，位于細胞凋亡機制中的核心地位[5]。其中caspase-3為凋亡的最終執行者，活化后可降解細胞核、細胞骨架及細胞質中的重要蛋白質，最終導致細胞凋亡。Sun等[6]在海人藻酸誘導的驚厥持續狀態大鼠模型中發現，免疫組化和western blot結果表明caspase-3顯著增加，RT-PCR提示大鼠海馬caspase-3 mRNA表達明顯增加，達峰于驚厥后72h。本研究結果顯示，caspase-3 mRNA的表達在驚厥后早期（4h）已有升高（P＜0.05），且隨觀察時間的延長逐步升高，達峰于驚厥后72h，其動態變化與TUNEL檢測的神經元凋亡的規律一致，與文獻報道類似[6]。這一結果證實caspase-3的活化與驚厥發作后的神經元凋亡密切相關。

TLR4是一種跨膜識別受體，分為細胞外、細胞膜和細胞內3部分，在CNS可表達于神經細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞等[7]。TLR4活化后，主要通過TRIF和MyD88依賴的兩條信號通路激活NF-κB，活化的NF-κB進入細胞核進行轉錄調控，誘導細胞凋亡的產生[8]。在小鼠癲癇模型中發現，在癲癇小鼠海馬神經元、小膠質細胞、星型膠質細胞中均有大量TLR4的表達，抑制TLR4后癲癇發作程度減輕[9]。而敲除TLR4基因的C3H/HJ型小鼠能抑制癲癇的發作[10]。本研究發現，TLR4 mRNA的表達在驚厥后4h已有所升高，且隨觀察時間的延長進一步增加，達峰于驚厥后72h，提示在驚厥性腦損傷大鼠海馬細胞中TLR4被活化，且NF-κB表達量的增加與TLR4的上調呈正相關，說明TLR4活化的同時伴有細胞核內NF-κB的激活。由此可見，驚厥發作可激活TLR4/NF-κB通路，活化后的TLR4的作為重要的炎性受體介導驚厥持續狀態的免疫損傷。

但TLR4/NF-κB通路的激活是否與驚厥持續狀態后神經細胞凋亡密切關聯呢？在海人酸所致的癲癇小鼠模型中發現，NF-κB的活化促進了海馬神經元凋亡的發生，而抑制NF-κB可顯著減少神經細胞的凋亡，表明NF-κB的激活與驚厥后神經細胞的凋亡密切相關[11]。研究小膠質細胞的凋亡機制后發現，活化的TLR4可以上調NF-κB的表達，NF-κB活化后進入細胞核內激活caspase-11，最終引起caspase-3的活化而促使細胞凋亡發生[12]。本研究結果表明，驚厥后大鼠海馬TLR4/NF-κB通路的激活與caspase-3的表達和凋亡細胞數有顯著相關，因此，筆者推測TLR4/NF-κB信號通路可能通過活化caspase-3參與了驚厥后海馬細胞凋亡的發生。

PDTC是一種NF-κB活化的抑制劑，在多種細胞中可以抑制NF-κB的活性[13]。Pfeilschifter等[14]在小鼠中風模型中發現，PDTC可以通過激活p38 MAPK信號途徑減少腦梗死面積及減輕腦血管內皮細胞的凋亡。Wang等[15]研究新生大鼠缺血缺氧性腦病模型發現，PDTC可以下調caspase-3的表達，減少NF-κB的核易位和海馬神經細胞的凋亡，從而減輕缺血缺氧引起的腦損傷。本研究結果顯示，PDTC可以減輕驚厥持續狀態后大鼠海馬組織的病理損傷，其原因可能是由于PDTC抑制了NF-κB的活性，使caspase-3的表達下降，從而減輕了細胞凋亡的程度。從RT-PCR的結果看，PDTC也抑制了TLR4的表達，這可能與NF-κB的活性被PDTC阻斷了有關。TLR4的活化激活了NF-κB，而活化的NF-κB對TLR4也有反饋作用。有研究發現，LPS、γ-干擾素（IFN-γ）、IL-1β等可以增加TLR4在內皮細胞中的表達，PDTC可以抑制由它們活化的TLR4表達上調，同時正常細胞中TLR4的表達也受到PDTC的抑制，這一結果提示TLR4的表達依賴于NF-κB調節[16]。Zhao等[17]研究也提示，抑制NF-κB的活性可以下調TLR4在樹突狀細胞表面的表達。TLR4激活NF-κB的途徑至今研究較多，但NF-κB如何調控TLR4的機制目前還不明了。也許是NF-κB激活的細胞因子誘導了TLR4的表達，也可能是NF-κB的核轉移誘導了TLR4基因的轉錄，這些都還需要深入的研究。

綜上所述，驚厥持續狀態后海馬中存在神經細胞的凋亡，TLR4/NF-κB信號通路可能通過caspase-3來介導這一細胞損傷。PDTC可能通過抑制TLR4/NF-κB通路來減輕驚厥后神經細胞的凋亡，為驚厥后腦損傷的保護機制提供可能的依據。

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（本文編輯：嚴瑋雯）

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本刊編輯部

Effects of PDTC on expression of Toll-like receptor 4,caspase-3 and neuron apoptosis in hippocampus of status convulsion rats

ZHOU Qin,ZHANG Qin，LI Guangqian,et al.Department of Pediatrics,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

Convulsion Apoptosis Tolllike receptor 4 NF-κB Caspase-3 PDTC

2015-12-11）

浙江省中醫藥科學研究基金計劃（2011ZB014）

310014 杭州，浙江省人民醫院兒科（周琴、張勤）；杭州市兒童醫院神經科（李光乾、周素芽）

周素芽，E-mail：suya.zhou@163.com