人源臍帶間充質干細胞移植治療大鼠佐劑骨關節炎的對照研究

蔣峰 楊孝兵 張帆 壽旗揚 徐志國

人源臍帶間充質干細胞移植治療大鼠佐劑骨關節炎的對照研究

蔣峰 楊孝兵 張帆 壽旗揚 徐志國

目的 探討人源臍帶間充質干細胞（hUc-MSCs）治療大鼠佐劑骨關節炎（OA）的價值。方法 將42只大鼠按抽簽法分為7組，G組為正常對照組，其余6組進行右后肢膝關節注射0.1%碘乙酸0.1ml造模；A組造模后第6周處死（空白對照）；B組造模后第6周注射0.9%氯化鈉溶液，第10周處死；C組造模后第6、8周2次注射0.9%氯化鈉溶液，第12周處死；D組造模后第6周1次關節腔注射hUc-MSCs，第10周處死；E組造模后第6、8周2次關節腔注射hUc-MSCs，第12周處死；F組造模后第6、8周2次尾靜脈注射hUc-MSCs，第12周處死；各組大鼠造模前后和注射后測定關節腫脹度和疼痛評分；處死后取關節組織病理檢查。結果 D、E組較B、C組的關節腫脹度均有減小，E組的消腫作用更顯著；而F組的消腫作用不明顯；D、E組關節疼痛評分較B、C組均有緩解，E組止痛作用更顯著；F組的止痛作用與E組相當。Mankin關節軟骨病理分級積分結果提示：D組與B組比較無統計學差異；F組低于C組；而E組低于F組。病理檢查提示：A組造模后第6周關節組織病理檢查類似于OA病理表現，無宿主與移植物的相互排斥反應發生；B組表現類似A組，C組關節病理破壞較B組重；D組滑膜重度增生侵入關節腔，炎癥細胞浸潤，其病理破壞較A組重，較C組輕，并且軟骨染色較淺；E組滑膜增生和炎癥較D組輕，軟骨染色較D組更淺；F組關節病理表現與E組基本相仿；在飼養、造模、注射、觀察的實驗過程中，無明顯局部或者全身的宿主與移植物相互排斥反應發生，未發現注射部位、關節感染、壞死等不良反應，無意外疾病和死亡發生。結論 2次關節腔注射和尾靜脈注射hUc-MSCs均能較好緩解碘乙酸佐劑OA的疼痛，改善滑膜炎癥，修復軟骨等作用，而且2次關節腔注射hUc-MSCs能更明顯能消除關節腫脹，減輕滑膜炎癥和軟骨損害的病理改變；無明顯的不良反應發生；hUc-MSCs治療OA具有良好的有效性和安全性。

人源臍帶間充質干細胞 佐劑 骨關節炎 實驗性 移植注射

骨關節炎（osteoarthritis，OA）已成為中老年人群慢性致殘，喪失工作能力的第2位原因[1]。OA的病理表現以關節軟骨退化、破潰和脫落以及周圍軟組織炎癥、骨質增生為特征；由于關節軟骨缺乏血管和神經，且軟骨細胞包裹在致密的軟骨基質中，不易遷移至損傷區域參與修復，探索軟骨損傷修復新方法一直是臨床研究的熱點問題[2]，對于內科非手術治療無效、伴有關節功能障礙的重度OA，主要通過關節鏡手術、開放手術或關節置換術等治療，但由于手術治療本身的創傷、療效的不確定性和術后長期臥床引起的肌肉萎縮、骨質疏松、嚴重感染、靜脈血栓等并發癥，使近期和遠期療效均不甚滿意。如何從OA病因學入手，解決軟骨的再生問題一直是臨床醫師追求的目標[3]。1994年Brittberg[4]就嘗試將自體軟骨細胞移植用于治療膝關節病的軟骨缺損，由于軟骨細胞來源有限、生物學功能不易保持，而且取材困難、提取細胞的部位會出現軟骨損傷和缺損，形成新的軟骨損傷等因素，限制了臨床的實際應用。因此，近年來研究由對軟骨缺損的修復轉向干細胞。臍帶間充質干細胞（hUc-MSCs）具有獲取容易、擴增能力強、歸巢性良好、分化為軟骨細胞的潛能、無致瘤性、無醫學倫理學爭議等諸多優點，作為軟骨修復的種子細胞具有巨大應用價值[5]。為探討hUc-MSCs治療OA的效果，筆者建立大鼠膝關節佐劑OA模型，觀察膝關節腔和尾靜脈移植注射hUc-MSCs對減輕膝關節腫脹疼痛的療效以及對受損軟骨修復作用和不良反應，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 hUc-MSCs由國家干細胞工程產品產業化華東基地、協和華東干細胞基因工程有限公司提供；Wistar雄性大鼠42只，體重200～250g，由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供，SPF級（合格證編號：2008001628775）；清潔級標準飼養。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組和模型制備 按抽簽法將42只大鼠分為A～G 7組，每組6只。造模前禁食12h并稱重記錄，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液（按30mg/kg注射）麻醉；麻醉后仰臥位固定；選擇大鼠右后肢膝關節，腔內注射0.1ml的0.1%碘乙酸溶液造模，1周即可引起軟骨細胞區域性變性和壞死，軟骨基質降解[6]，其癥狀、體征、病程變化和病理表現與OA表現相近[7]。造模后，注射關節部位無菌包扎（不固定）后置于籠內自由活動。

1.2.2 處理方法 A組：造模后第6周按要求測定關節腫脹度、疼痛評分后處死，取關節組織作病理檢查；B組：造模后第6周關節腔注射0.9%氯化鈉溶液，第10周測定關節腫脹度、疼痛評分后處死，取關節組織作病理檢查；C組：造模后第6、8周關節腔注射0.9%氯化鈉溶液，第12周測定關節腫脹度、疼痛評分后處死，取關節組織作病理檢查；D組：造模后第6周關節腔注射hUc-MSCs，第10周（即注射hUc-MSCs細胞后4周）測定關節腫脹度、疼痛評分后處死，取關節組織作病理檢查；E組：造模后第6、8周分別關節腔注射hUc-MSCs，第12周測定關節腫脹度、疼痛評分后處死，取關節組織作病理檢查；F組：造模后第6、8周分別尾靜脈注射hUc-MSCs，第12周測定關節腫脹度、疼痛評分后處死，取關節組織作病理檢查；G組（正常對照組）：與6組實驗組同時飼養，第6、12周測定關節腫脹度和疼痛評分后處死，取關節組織作病理檢查。

1.2.3 注射方法

1.2.3.1 膝關節腔注射方法 將大鼠固定在手術臺上，膝關節皮膚局部消毒后使用1ml無菌注射器行膝關節腔注射，每次注射0.9%氯化鈉液0.2ml或者移植注射hUc-MSCs細胞1.0×105/ml（約0.2ml）。無菌包扎并標記后置于籠內自由活動，膝關節不固定。

1.2.3.2 大鼠尾靜脈注射方法 將大鼠固定在手術臺上，尾部局部消毒后使用1ml無菌注射器行尾靜脈注射，每次移植注射hUc-MSCs細胞1.0×105/ml（約0.2 ml）。

1.3 大鼠移植注射后的療效評估時間和方法 （1）關節腫脹度測定：在造模前和造模第4、6、8、10、12周時，采用足趾容積測量儀準確測量并記錄每只受試大鼠的足趾容積，計算腫脹度（腫脹度△ml=實驗后容積-實驗前容積）[8]。（2）關節疼痛：在造模前和造模第4、6、8、10、12周時，將大鼠裝進特制的透明塑料筒內，放

于特制的鐵架上，尾部和實驗的膝關節、后腿伸出筒外，穩定3min后進行測定，將膝關節緩慢伸直，再屈曲膝關節，每隔5s進行1次，共5次。屈曲關節時動物若出現嘶叫或短促而明顯的縮腿反應評分為1分，無反應為0分。記錄其嘶叫和縮腿評分，每次合計評分為0～5分[9]。

1.4 病理切片的制作 大鼠處死后，取實驗膝關節，矢狀位切取3mm厚帶軟骨下骨質的關節軟骨，包括關節兩端的小段骨組織，盡量剝離附著的肌肉，在中性甲醛溶液中固定72h，于100ml/L硝酸甲醛溶液混合液（100ml/L硝酸+100ml/L中性甲醛溶液+雙蒸水補足1L）中脫鈣48h，常規脫水，石蠟包理，5μm厚連續切片，分別采用蘇木精-伊紅染色（HE染色）和番紅-固綠染色（SO/FG染色），光學顯微鏡下觀察。

1.5 軟骨病理評分 參照Mankin關節軟骨病理評分標準進行分級評定：（1）結構評分：正常0分，表層有破壞1分，血管翳與表層破壞2分，淺層裂隙形成到達移行層3分，裂隙局限性深達骨質輻射層4分，深達骨質鈣化層缺損負重區5分，全層軟骨缺損6分。（2）細胞評分:正常0分，細胞過多、紊亂1分，細胞成簇2分，細胞少3分。（3）SO/FG染色:正常0分，輕度失染1分，中度失染2分，重度失染3分，完全失染4分。（4）潮線的完整性：完整0分，不完整、有血管通過1分。總分0～14分，正常0～2分，輕度病變3～7分，中度病變8～11分，重度病變12～14分，

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件，計量資料采用表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 造模前后大鼠的不良反應 42只大鼠在飼養、造模、注射、觀察過程中，無明顯局部或全身的宿主與移植物排斥反應，未發現關節靜脈注射部位感染、壞死等不良反應，無意外疾病和死亡發生。

2.2 各組大鼠關節足趾容積和腫脹度的比較 見表1。

表1 各組大鼠關節足趾容積和腫脹度的比較

由表1可見，D組關節腫脹度較B組小，差異有統計學意義（P＜0.05）；E組較C組關節腫脹度小，差異有統計學意義（P＜0.01）；F組較C組關節腫脹度小，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠關節疼痛評分的比較 見表2。

表2 各組大鼠關節疼痛評分的比較（分）

由表2可見，D組關節疼痛評分較B組減小，差異有統計學意義（P＜0.05）；E組關節疼痛評分較C組減小，差異有統計學意義（P＜0.01）；F組關節疼痛評分較C組減小，差異有統計學意義（P＜0.05）；F組關節疼痛評分較E組減小，差異無統計學意義（P＞0.05）；E組關節疼痛評分較D組低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠關節軟骨病理評分與病理檢查結果

2.4.1 各組大鼠的關節軟骨病理評分的比較 見表3。

2.4.2 各組大鼠關節組織病理檢查 G組光鏡下關節面光滑、無滑膜增生、無炎癥細胞浸潤；A組光鏡可見關節面欠光滑，細胞壞死、炎癥細胞浸潤和滑膜增生，無宿主與移植物的相互排斥反應發生，類似于OA病理表現，提示造模方法成功；B組、C組光鏡下，B組表現類似A組，提示造模后第6周注射0.9%氯化鈉溶液不改變造模后的關節病理影響，C組關節病理破壞較B組重，說明隨著時間延長，關節破壞進行性加重；D組病理表現滑膜重度增生侵入關節腔，炎癥細胞浸潤，其軟骨破壞較A組重，較C組輕，并且軟骨染色較淺；E組關節滑膜增生和炎癥細胞浸潤較D組輕，軟骨染色較D組更淺，提示關節腔注射hUc-MSCs細胞，對佐劑OA具有減輕炎癥、修復軟骨的作用，2次注射較1次注射療效更好；F組關節病理表現軟骨著色深，呈紫紅色，滑膜增生和炎癥細胞浸潤與E組基本相仿，提示靜脈2次注射hUc-MSCs與關節腔2次注射hUc-MSCs，療效相當，具有同樣的減輕佐劑OA病理炎癥、修復軟骨的作用（見圖1-7，見插頁）。

表3 各組大鼠Mankin關節軟骨病理評分的比較（分）

3 討論

目前認為OA的發病是多因素的，至少與機械性、生物性以及免疫性炎癥相關，具體機制尚未十分清楚，可能是由于骨的重塑部位軟骨損傷、骨膜炎癥、骨質增生所致，也可能是軟骨下骨質的微創傷、微骨折刺激滑膜、關節囊炎癥，各種炎性細胞因子包括前列腺素、白三烯、IL-1、IL-6的釋放，引起周圍肌肉痙攣疼痛、軟組織炎癥，造成骨內壓增高、骨血供減少，甚至發生缺血壞死[10]。目前OA的治療方法主要以控制炎癥和疼痛癥狀為主，即使患者癥狀緩解，仍然沒有逆轉其病理過程，其關節軟骨難以修復，長期療效不甚滿意，近年來越來越多的學者開始關注hUc-MSCs在內的干細胞治療[11]。

hUc-MSCs起源于中胚層，是干細胞家族的重要成員之一，是成體干細胞的一種，曾被稱為塑料貼壁細胞或成纖維細胞集落形成單位，能分化為中胚層的多種成熟組織細胞，如骨、軟骨、脂肪、肌肉、軟骨和血管內皮等。有研究表明hUc-MSCs表達低水平MHC-II類分子和Fas配體，不表達MHC-I類分子，也不表達共刺激分子B7-1、B7-2、CD40和CD40L[12]，所以hUc-MSCs免疫原性非常弱，不激活異基因活化的T淋巴細胞，只有很低的免疫原性和抗原提呈能力，由于人源臍帶來源廣泛、獲取容易，加上具有較好的成軟骨潛力，并能通過分泌多種保護性生物活性因子，防止和延緩軟骨組織進一步破壞和免疫調節等改善局部微環境的功能，同時具有刺激剩余軟骨祖細胞原位再生的能力，以及良好的擴增能力強、歸巢性、非致瘤性、無醫學倫理學爭議等優點，hUc-MSCs已為細胞療法中的主要選擇細胞[13-14]。

有研究表明大鼠膝關節腔注射碘乙酸，可引起大鼠膝關節脛骨平臺和股骨裸處軟骨全層性的炎性改變，方法簡便、創傷小、發展較快、重復性好，能較好模擬人的膝關節OA表型[6-7，15]。本實驗大鼠膝關節腔注射碘乙酸后的關節病理檢查，可以看到關節面毛糙，細胞壞死和滑膜增生，炎癥細胞浸潤，同時隨著時間延長，關節破壞進行性加重，類似于OA表現，同時碘乙酸誘發的大鼠膝關節有較好的均一性和可比性。

本實驗采用碘乙酸佐劑制備OA動物模型，觀察發現2次關節腔注射和尾靜脈注射hUc-MSCs均能有效緩解關節疼痛，改善滑膜炎癥，修復軟骨等作用，而且2次關節腔注射hUc-MSCs能更明顯消除關節腫脹，減輕滑膜炎癥和軟骨損害的病理改變；實驗中無明顯的不良反應發生；進而證實hUc-MSCs治療OA具有良好的有效性和安全性。本研究存在的主要不足是研究還處于大鼠動物實驗階段；對hUc-MSCs減輕炎癥的機制，特別是炎性因子的變化不明了；軟骨細胞再生和（或）軟骨祖細胞原位再生，以及受損關節軟骨修復過程和機制不清。

綜上所述，hUc-MSCs能有效緩解骨關節炎疼痛，改善滑膜炎癥，修復軟骨等，具有較高的安全性和療效，值得進一步推廣和深入研究。

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Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells implantation in treatment of rat adjuvant arthritis

JIANG Feng,YANG Xiaobing,ZHANG Fan,et al.Department of Rheumatology and Immunology,Huzhou Third Municipal Hospital,Huzhou 313000,China

Objective To investigate the efficacy of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells(hUc-MSCs) implantation in treatment of rat adjuvant arthritis. Methods Forty two rats were randomly divided into 7 groups with 6 animals in each.Acetic acid was injected in right hind joint to induce the arthritis in groups A,B,C,D,E,F；group G served as blank control group.Rats in group Awere sacrificed at wk 6 after the modelwas made (modelgroup),rats in group B were injected with normal saline at wk 6 and sacrificed at wk 10;rates in group C were injected with normal saline at wk 6,8 and sacrificed at wk 12;rats in group D were injected with hUc-MSCs in articular cavity at wk 6 and sacrificed at wk 10;rats in group E were injected with hUc-MSCs in articular cavity at wk 6,8 and sacrificed at wk 12;rats in group F were injected with hUc-MSCs through tail vein at wk 6,8 and sacrificed at wk 12.The swelling degree and pain degree of rats before and after model made and before and after treatment were evaluated.Pathological examinations in joints were performed after sacrifice. Results Compared with groups B and C,the joint swelling degree of group D and E was reduced and that of group E were significantly reduced while the change of group F was not significant.Compared with groups B and C,the average pain scores of group D and E were reduced and the analgesic effect in group E and F was more significant.The result of the pathological grades of Mankin articular cartilage showed that there was no difference between group D and group B,that of group F was better than group C while that of group E was better than group F.The pathological examination at wk 6 in groups A and B showed the manifestations of osteoarthritis and no graft rejection responses.In group D,the proliferated synovial membrane invading the aricular cavity with infiltration ofinflammatory cells,the pathological damage was more severe than that of group A,but lighter than group C.The synovial proliferation and inflammation in group E was lighter than that in group D,and cartilage staining was more shallow than that in group D.The pathological damage of group F was similar to that in group E. Conclusion The injection of hUc-MSCs in joint or in tail vein can release joint pain of osteoarthritis,improve synovitis,and repair cartilage damage,suggesting that hUc-MSCs implantation is effective and safe for treatment ofosteoarthritis in rats.

hUc-MSCs AdjuvantOsteoarthritis ExperimentalImplatation

2015-11-13）

（本文編輯：嚴瑋雯）

湖州市生物醫藥重大專項計劃（2011ZD2007）

313000 湖州市第三人民醫院風濕免疫科（蔣峰、楊孝兵、張帆）；浙江中醫藥大學動物實驗研究中心（壽旗揚）；協和華東干細胞基因工程有限公司（徐志國）

蔣峰，E-mail：JF2025018@163.com