不同部位Ⅲ期結直腸癌的臨床及錯配修復基因表達的比較分析

陳萬源 鞠海星 吳偉 胡錦林 李德川

不同部位Ⅲ期結直腸癌的臨床及錯配修復基因表達的比較分析

陳萬源 鞠海星 吳偉 胡錦林 李德川

目的 探討不同部位Ⅲ期結直腸癌患者的臨床病理及錯配修復基因表達的的差異。方法 應用En-Vision二步法檢測340例結直腸癌中hMLH1、hMSH2和hMSH6的表達，并分析不同部位結直腸癌的臨床病理及hMLH1、hMSH2、hMSH6的差異。結果 340例Ⅲ期結直腸癌中，右半結腸、左半結腸和直腸癌分別為60、68和212例，腫瘤侵潤深度、腫瘤細胞分化程度在右半結腸、左半結腸和直腸癌中均有統計學差異（均P＜0.05），而患者年齡、性別、淋巴結轉移數在不同部位腫瘤中均無統計學差異（均P＞0.05）。在右半結腸、左半結腸和直腸癌中hMLH1表達缺失率分別為13.4%、2.9%和5.7%，差異有統計學意義（P＜0.05）；hMSH2分別為6.7%、1.5%和 4.7%，差異有統計學意義（P＜0.05）；hMSH6分別為3.3%、2.9%和1.9%，差異無統計學意義（P＞0.05）；MMR（hMLH1+hMSH2+hMSH6）分別為23.3%、7.4%和11.8%，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 不同部位的Ⅲ期結直腸癌中，其臨床病理及hMLH1、hMSH2、hMSH6差異明顯。

結腸直腸腫瘤 錯配修復基因 免疫組織化學

結直腸癌是世界常見惡性腫瘤之一，我國結直腸癌的發病構成中，結直腸癌發病出現右移。10年前，直腸癌發病率一直高于結腸癌，近年來結腸癌高于直腸癌，這種變化可能是多種因素促成[1]。臨床資料顯示，Ⅲ期結直腸癌在所有結直腸癌中一直占有較高的比例[2]。由于左、右半結腸的解剖學結構和生理功能不同，其腫瘤發生機制也可能存在差異。錯配修復基因（mismatch repair genes，MMR）缺陷引起微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）在林奇綜合征發生中起主要作用，近年來研究表明，MMR對部分結直腸癌的診斷、藥物選擇及預后判斷等具有重要意義，而在MMR中hMLHl、hMSH2及hMSH6起主要作用。MMR的突變缺失也參與散發性結直腸癌（sporadic colorectal cancer，SCRC），但其發病機制及臨床意義尚未明確。為了探討MMR表達缺失在SCRC腫瘤發生、發展中的作用，筆者采用免疫組化法檢測SCRC中hMLHl、hMSH2及hMSH6的表達情況并分析其臨床意義，現報道如下。

1 對象和方法

1.1對象 收集我院2013年2月至2015年8月間收治的Ⅲ期結直腸癌340例，男202例（59.4%），女138例（40.6%）；年齡27～89歲，中位年齡57歲。其中結腸癌128例，直腸癌212例。所有患者術前均未行放療和化療，均經過組織學證實，排除病理學分型為惡性淋巴瘤、神經內分泌瘤及間質瘤。

1.2 方法 hMLH1（G168-728）、hMSH2（FE11）及hMSH6單克隆抗體均購自Invitrogen公司；工作濃度hMLH1（1∶100），hMSH2（1∶200），hMSH6（1∶100）。標本經10%中性緩沖甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，4μm切片；10mmol/ L pH6.0的檸檬酸緩沖液高壓噴氣修復抗原；采用En-Vision二步法，在半自動免疫組化儀上脫蠟、復染、脫水、顯色。結果判斷：hMLH1、hMSH2及hMSH6定位于細胞核，以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞，參照Shia等評定標準[3]，只有全部腫瘤細胞核無hMLH1或hMSH2或hMSH6表達時為陰性，而弱染色（＜10%腫瘤細胞著色或核染色淺黃色）、異質性染色（陽性腫瘤細胞片塊狀分布）均不作陰性判讀。以切片內癌旁正常腸黏膜上皮和（或）淋巴、纖維細胞作陽性內對照，TBS代替一抗作陰性對照。所有免疫組化染色結果由2位病理科醫師復核。

1.3 統計學處理 應用SPSS13.0統計軟件，hMLHl、hMSH2及hMSH6表達與臨床病理參數之間的比較采用χ2檢驗或精確概率法。

2 結果

340例不同部位Ⅲ期結直腸癌患者的臨床病理見表1，在Ⅲ期結直腸癌中直腸癌占的比例明顯多于結腸癌；不同的發病部位之間的腫瘤侵潤深度、病理類型比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），而其他臨床特征比較均無統計學差異（均P＞0.05）。免疫組化結果顯示，340例結直腸癌中，hMLHl表達缺失22例（6.5%）（見圖1），hMSH2表達缺失15例（4.4%）（見圖2），hMSH6表達缺失8例（2.4%），其中1例直腸癌hMLHl、hMSH2表達均缺失；hMLHl表達缺失在右半結腸為8例（13.4%），明顯高于左半結腸2例（2.9%）和直腸12例（5.7%），差異均有統計學意義（均P＜0.05），hMSH2在不同部位結直腸癌中的表達差異有統計學意義（P＜0.05），而hMSH6表達缺失在不同部位結直腸癌中的差異無統計學意義（P＞0.05）。同時結果顯示，hMLH1+hMSH2+hMSH6表達缺失在右半結腸癌中共14例（23.3%），左半結腸癌5例（7.45%），直腸癌26例（11.8%），差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

圖1 hMLH1表達缺失（HE染色）

圖2 hMSH2表達缺失（HE染色）

3 討論

MMR基因突變導致其蛋白表達產物產生缺陷而失去錯配修復功能，引起MSI或DNA修復錯誤，增加細胞基因組的不穩定，引起細胞增殖及異常分化，最終導致多種腫瘤的發生。MMR基因突變作為林奇綜合征的診斷依據已被公認，但MMR基因突變在SCRC中并不少見，Kim等[4]研究發現，MMR基因突變多發生于右半結腸癌，而且這類患者的腫瘤分化程度也較低，黏液腺癌/印戒細胞癌的比例較高。Iacopeta等[5]研究發現，MMR基因突變的結直腸癌多發生于右半結腸，多為黏液腺癌，并且發病年齡較小，其他研究也有相似結果，可見多數研究對于MMR基因突變的患者具有病理分化較差、多為黏液腺癌、好發于右半結腸等臨床病理特征達成共識。本研究表明，在Ⅲ期結直腸癌中，不同部位腫瘤患者的臨床特征及MMR基因突變存在差異，右半結腸癌患者腫瘤分化程度較差（黏液腺癌/印戒細胞癌）的比例高于左半結腸癌及直腸癌，而淋巴結轉移數較少，出現大于3顆淋巴結轉移的比例少于左半結腸癌及直腸癌。

既往研究表明，MMR基因突變多發生于右半結腸癌，較少出現淋巴結轉移[6]，Gay等[7]研究發現，MMR基因缺失患者分期相對較早（DukeA/B）。本研究結果顯示，不同部位的Ⅲ期結直腸癌中，其hMLHl、hMSH2及hMSH6表達缺失存在差異，hMLH1、hMSH2表達缺失在右半結腸癌中的比例明顯高于左半結腸癌、直腸癌，差異有統計學意義；同時，右半結腸癌腫瘤分化差、hMLH1表達缺失比例高，可能原因是分化差的癌細胞增殖分裂加快，其基因發生錯配的概率增加，導致hMLH1表達缺失率上升。

表1 不同部位Ⅲ期結直腸癌的臨床病理比較

關于MMR基因突變與結直腸癌預后的關系備受關注。Dietmaier[8]分析提示，MMR缺陷患者總生存較MMR正常的患者明顯延長，是預后預測因素，而Vlaykova等[9]認為，MMR缺陷的SCRC患者OS較MMR正常的患者無明顯差異，MMR對于結直腸癌患者選擇合適的治療方案具有指導意義，大量臨床試驗發現MMR或MSI的腫瘤對常用化療藥如5-Fu、DDP等耐藥，因此近年來對于Ⅱ期結直腸癌患者推薦進行MSI或MMR基因突變的檢測，如果存在hMLHl及hMSH2缺失或MSI-H腫瘤，不建議這部分患者使用5-FU類藥物單藥進行術后輔助化療。MMR在SCRC中具有相對特殊的臨床病理，在出現淋巴結轉移的Ⅲ期結直腸癌中是否具有預測預后的價值，有待進一步研究。

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[2]陳萬源,范永田,劉勇,等.浙江省腫瘤醫院近20年結直腸癌臨床特征變化分析[J].中國腫瘤,2014,23(7):563-566.

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[9]Vlaykova T,Mitkova A,Stancheva G.Microsatellite instability and promoter hypermethylation of MLH1 and MSH2 in patients with sporadic colorectalcancer[J].J BUON,2011,16(2):265-273.

Clinicopathological and molecular features of stageⅢ colorectal cancer at different sites

CHEN Wanyuan,JU Haixing,WU Wei,et al.Department of Colorectal Surgery，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022,China

【 Abstract】 Objective To examine the clinicopathological and molecular features of colorectal cancer at different sites. Methods The clinicopathological data of 340 cases of stage III colorectal cancer were collected.The expressions of hMLHl, hMSH2 and hMSH6 protein were examined with EnVision immunohistochemistry,and the clinicopathological and molecular features of colorectal cancer at different sites were assessed with univariate analysis. Results There were significant differences in tumor invasive depth and differentiation among right-sided colon,left-sided colon and rectal cancers.There were no significant differences in age,gender and lymph node metastasis among tumors at different sites(P＞0.05).The lost expression rate of hMLH1 in right-sided colon,left-sided colon and rectal cancers was 13.4%,2.9%and 5.7%,respectively(P＜0.05);that of hMSH2 was 6.7%,1.5%and 4.7%,respectively(P＜0.05);that of hMSH6 was 3.3%,2.9%and 1.9%,respectively (P＞0.05);while that of MMR (hMLH1+hMSH2+hMSH6)was 23.3%,7.4%and 11.8%,respectively(P＜0.05). Conclusion There are significant differences in clinicopathological and molecular features among stageⅢcolorectal cancers at right colon, left colon and rectum.

Colorectalcarcinoma Mismatch repairgene Immunohistochemistry

2015-11-09）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省自然科學基金（Y207427）；錢江人才計劃（2013R 10079）

310022 杭州，浙江省腫瘤醫院結直腸外科（陳萬源、鞠海星、李德川），病理科（吳偉、胡錦林）

鞠海星，E-mail：juhaixing@126.com