芹菜素對(duì)氧嗪酸鉀鹽致高尿酸血癥小鼠的降尿酸及腎保護(hù)作用機(jī)制研究Δ

繆明星，王 星，陸 琰，王 欣（.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 0009；.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥劑科，南京 0008）

芹菜素對(duì)氧嗪酸鉀鹽致高尿酸血癥小鼠的降尿酸及腎保護(hù)作用機(jī)制研究Δ

繆明星1＊，王 星1，陸 琰1，王 欣2（#1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 210009；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥劑科，南京 210008）

目的：研究芹菜素對(duì)氧嗪酸鉀鹽致高尿酸血癥小鼠的降尿酸及腎保護(hù)作用機(jī)制。方法：將50只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、別嘌呤醇組（5 mg/kg）與芹菜素低、高劑量組（40、80 mg/kg），每組10只。除正常組外，其余各組小鼠ig氧嗪酸鉀250 mg/kg復(fù)制高尿酸血癥模型，造模后1 h，各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物，正常組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。測(cè)定各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平和腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)蛋白（mURAT1、mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2）表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠血尿酸、尿尿酸、mURAT1水平顯著升高，mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2水平和24 h尿肌酐水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.001）；與模型組比較，芹菜素低、高劑量組及別嘌呤醇組小鼠血尿酸、尿尿酸、mURAT1水平顯著降低，24 h尿肌酐水平、mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。結(jié)論：芹菜素能降低氧嗪酸鉀鹽致高尿酸血癥小鼠的尿酸水平，保護(hù)腎臟；其作用機(jī)制可能與下調(diào)小鼠腎臟中mURAT1水平，上調(diào)mOCTN1、mOCTN2、mOCT1及mOCT2水平相關(guān)。

芹菜素；高尿酸血癥；腎保護(hù)作用；腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)蛋白；機(jī)制；小鼠

高尿酸血癥是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的代謝性疾病，可造成腎功能不全。高尿酸血癥與痛風(fēng)、高血壓、腎臟疾病及代謝綜合征有關(guān)[1-2]，其標(biāo)志是腎臟尿酸鹽分泌功能受損[3]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道腎臟陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子，如尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子1（URAT1，編碼為SLC22A12），在腎臟中介導(dǎo)尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。因此，高尿酸血癥藥物作用的靶點(diǎn)與腎臟有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)子有關(guān)[5-6]。

芹菜中含有大量芹菜素，前期研究表明芹菜素可以降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平[7]。還有研究報(bào)道芹菜素對(duì)氧嗪酸鹽誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠具有促尿酸排泄功能[8]。芹菜素對(duì)肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）活性的抑制作用與別嘌呤醇相比不足以逆轉(zhuǎn)高尿酸血癥小鼠的尿酸水平，表明芹菜素可能是通過(guò)其他途徑調(diào)控腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的。目前關(guān)于芹菜素對(duì)氧嗪酸鉀致小鼠高尿酸血癥的降尿酸及腎保護(hù)作用機(jī)制研究尚不是很清楚，而小鼠腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和人比較相似[9]。因此，在本研究中筆者ig氧嗪酸鉀以復(fù)制高尿酸血癥小鼠模型，給藥后評(píng)價(jià)芹菜素降尿酸活性，同時(shí)研究其與mURAT1、mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2等尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，為芹菜素的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

XHF-D高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5810R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendrof公司）；754紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科學(xué)儀器有限公司）；7500實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)ABI公司）、ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 試劑

芹菜素（陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：Ap20010124，純度：≥98%）；別嘌呤醇（批號(hào)：13053006，規(guī)格：25 g，含量：98%）、氧嗪酸鉀（批號(hào)：12042001，規(guī)格：25 g，純度：98%）均購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；尿酸測(cè)定試劑盒（南京拜傲斯生物科技有限公司，貨號(hào)：700320）；肌酐測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：201401622）；Trizol RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)：15596026、18080051）；小鼠mOCT1、mOCT2兔源單克隆抗體（美國(guó)Thermo Scientific公司，貨號(hào)：PA528209、PA532526）；小鼠mOCTN1、mOCTN2兔源單克隆抗體（美國(guó)Santacruze公司，貨號(hào)：SC-19819、SC-19822）；小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（mGAPDH）、mβ-actin單克隆抗體（上海百研生物科技有限公司，貨號(hào)：E021010、E021020）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（南京生興生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：ESN134）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

KM小鼠50只，♂，體質(zhì)量（20±2）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005]。飼養(yǎng)環(huán)境：照明12 h/d，環(huán)境溫度（25±2）℃，濕度（55±5）%。

2 方法

2.1 分組、造模、給藥與取樣

將50只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、別嘌呤醇組（5 mg/kg）與芹菜素低、高劑量組（40、80 mg/kg），每組10只（劑量依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[8]確定）。除正常組外，其余各組小鼠ig氧嗪酸鉀250 mg/kg以復(fù)制高尿酸血癥模型。造模后1 h，各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物，正常組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，各組小鼠于眼球靜脈叢取血，離心（離心半徑為10 cm，3 000 r/min，下同）10 min，取血清，備用。之后脫頸椎處死小鼠，在冰臺(tái)上取小鼠肝臟和腎組織，用液氮冷凍后置于－80℃冰箱保存，備用。

2.2 各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平測(cè)定

給藥第6 d，于給藥1 h后每組取5只小鼠置于代謝籠內(nèi)，適應(yīng)1 d后，于給藥第7 d收集24 h尿液。尿液離心10 min，取上清液，測(cè)量尿液體積，另取“2.1”項(xiàng)下血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作分別測(cè)定各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平。

2.3 各組小鼠腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

取腎臟皮質(zhì)刷狀緣膜（BBMV）蛋白測(cè)定mURAT1、mOCTN1、mOCTN2和mβ-actin的蛋白表達(dá)，取腎臟皮層蛋白測(cè)定mOCT1、mOCT2和mGAPDH的蛋白表達(dá)。按文獻(xiàn)[10]的方法提取“2.1”項(xiàng)下小鼠腎組織中BBMV蛋白及腎臟皮層蛋白。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定BBMV和腎皮質(zhì)上清中的蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。蛋白統(tǒng)一稀釋后，在沸水中煮5 min備用。樣品經(jīng)12%的分離膠行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離后，在300 mA條件下將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上100 min，在5%脫脂奶粉封2 h后取出膜，刷狀緣膜蛋白分別用mURAT1（1∶1 000，V/V，下同）、mOCTN1（1∶1 000）、mOCTN2（1∶1 000）一抗和內(nèi)參mβ-actin（1∶1 000），腎臟皮層蛋白分別用mOCT1（1∶2 000）、mOCT2（1∶2 000）和內(nèi)參mGAPDH（1∶5 000），在4℃條件下孵育過(guò)夜。磷酸鹽-吐溫緩沖液（PBST）洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶10 000），化學(xué)發(fā)光法顯影。采用Chemi-Doc XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)掃描，測(cè)定條帶灰度值，采用Quantity One 4.62軟件進(jìn)行定量分析，以目的基因與內(nèi)參mβactin灰度值比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所用數(shù)據(jù)采用±s表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血尿酸、尿尿酸及24 h尿肌酐水平測(cè)定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血尿酸、尿尿酸水平顯著升高，24 h尿肌酐水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，芹菜素低、高劑量組及別嘌呤醇組小鼠血尿酸、尿尿酸水平顯著降低，24 h尿肌酐水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Results of blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels of mice in each grou（p±s，n＝10）

表1 各組小鼠血尿酸、尿尿酸、24 h尿肌酐水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 Results of blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels of mice in each grou（p±s，n＝10）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組模型組芹菜素低劑量組芹菜素高劑量組別嘌呤醇組劑量，mg/kg 40 80 5血尿酸，mg/L 34.78±2.09 45.85±3.08＊＊35.29±4.27##30.57±4.02##18.38±2.44##尿尿酸，mg/L 0.95±0.08 1.26±0.07＊＊1.08±0.05##0.96±0.08##1.03±0.09##24 h尿肌酐，mg/dl 24.19±1.46 17.13±1.26＊＊23.44±2.01##25.82±1.97##19.99±1.28#

3.2 各組小鼠腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

與正常組比較，模型組小鼠mURAT1水平顯著升高，mOCT1、mOCT2、mOCTN1、mOCTN2水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，芹菜素低、高劑量組、別嘌醇組小鼠mURAT1水平顯著降低，mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001），詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 各組小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)蛋白水平測(cè)定電泳圖Fig 1 Electrophoretogram for the determination of renal uric acid transporter related protein of mice in each group

圖2 各組小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果注：與正常組比較，＊＊＊P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001Fig 2 The expression of kidney transporter associated protein in mice in each groupNote：vs.normal group，＊＊＊P＜0.001；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

4 討論

芹菜素具有促尿酸排泄、改善腎功能的作用，具體表現(xiàn)為其可顯著降低高尿酸血癥小鼠血尿酸、尿尿酸水平。食物和細(xì)胞中若含有大量的嘌呤類(lèi)化合物，則伴隨著尿液尿酸鹽水平的上升，可能會(huì)導(dǎo)致患者體內(nèi)血清尿酸鹽水平的升高，由于人缺乏尿酸酶無(wú)法將尿酸降解成尿囊素，故尿酸是人體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物。目前有研究顯示連續(xù)ig芹菜素7 d可明顯降低小鼠24 h尿尿酸水平[11]。本研究結(jié)果表明，芹菜素低、高劑量及別嘌呤醇均可顯著降低高尿酸血癥小鼠的血尿酸、尿尿酸水平，同時(shí)顯著升高24 h尿肌酐水平。

芹菜素還可能通過(guò)其他機(jī)制降尿酸以保護(hù)腎功能。腎臟有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)子對(duì)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)及改善腎功能發(fā)揮著重要作用。目前已有研究證實(shí)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠腎臟組織有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（rOAT1）的mRNA和蛋白表達(dá)同時(shí)降低[12]。同時(shí)芹菜素可以改善四氧嘧啶造成的糖尿病小鼠腎功能異常從而發(fā)揮其腎保護(hù)作用，這可能與芹菜素調(diào)節(jié)腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用相關(guān)[13]。本研究表明，芹菜素對(duì)氧嗪酸鉀鹽致小鼠高尿酸血癥具有明顯的改善作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)高尿酸血癥小鼠腎臟mURAT1水平的表達(dá)，降低腎臟尿酸鹽重吸收能力，以及上調(diào)腎臟mOCT1、mOCT2、mOCTN1和mOCTN2表達(dá)水平相關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)芹菜素是防治小鼠高尿酸血癥合并腎功能不全的一種潛在藥物，這為研究芹菜素降尿酸活性及腎功保護(hù)機(jī)制提供了新思路。

[1] Bellomo G.The relationship between uric acid，allopurinol，cardiovascular events，and kidney disease progression：a step forward[J].Am J Kidney Dis，2015，65（4）：525.

[2] Dehghan A，Van HM，Sijbrands EJ，et al.High serum uric acid as a novel risk factor for type 2 diabetes[J].Diabetes Care，2008，31（2）：361.

[3] Eraly SA，Vallon V，Rieg T，et al.Multiple organic anion transporters contribute to net renal excretion of uric acid [J].Physiol Genomics，2008，33（2）：180.

[4] Caulfield MJ，Munroe PB，O’Neill D，et al.SLC2A9 is a high-capacity urate transporter in humans[J].PLoS Med，2008，5（10）：e197.

[5] 胡慶華，朱繼孝，李寧，等.梔子苷對(duì)氧嗪酸鉀鹽致小鼠高尿酸血癥的作用及其機(jī)制研究[J].中南藥學(xué)，2013，11（10）：722.

[6] Hu QH，Zhu JX，Ji J，et al.Fructus gardenia extract ameliorates oxonate-induced hyperuricemia with renal dysfunction in mice by regulating organic ion transporters and mOIT3[J].Molecules，2013，18（8）：8 976.

[7] Wang X，Wang CP，Hu QH，et al.The dual actions of Sanmiao wan as a hypouricemic agent：down-regulation of hepatic XOD and renal mURAT1 in hyperuricemic mice[J]. J Ethnopharmacol，2010，128（1）：107.

[8] Hu QH，Jiao RQ，Wang X，et al.Simiao pill ameliorates urate underexcretion and renal dysfunction in hyperuricemic mice[J].J Ethnopharmacol，2010，128（3）：685.

[9] 孫秀琴，李榮華，唐濤.芹菜素抗氧化作用進(jìn)展[J].中藥藥理與臨床，2012，28（1）：42.

[10] Keembiyehetty C，Augustin R，Carayannopoulos MO，et al.Mouse glucose transporter 9 splice variants are expressed in adult liver and kidney and are up-regulated in diabetes[J].Mol Endocrinol，2006，20（3）：686.

[11] Anzai N，Kanai Y，Endou H，et al.New insights into renal transport of urate[J].Curr Opin Rheumatol，2007，19（2）：151.

[12] Habu Y，Yano I，Takeuchi A，et al.Decreased activity of basolateral organic ion transports in hyperuricemic rat kidney：roles of organic ion transporters，rOAT1，rOAT3 and rOCT2[J].Biochem Pharmacol，2003，66（6）：1 107.

[13] 費(fèi)曜，羅華麗，劉凡.梔子對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠糖代謝及腎功能的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28（1）：42.

Mechanism Study on Effects of Apigenin on Reducing Uric Acid and Renal Protection in Oteracil Potassium-induced Hyperuricemia Mice

MIAO Mingxing1，WANG Xing1，LU Yan1，WANG Xin2（1.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Dept.of Pharmacy，the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China）

OBJECTIVE：To investigate the mechanism of the effects of apigenin on reducing uric acid and renal protection in oteracil potassium-induced hyperuricemia mice.METHODS：50 mice were randomly divided into normal group，model group，allopurinol group（5 mg/kg），apigenin low-dose and high-dose groups（40，80 mg/kg），with 10 mice in each group.Except for normal group，other groups were given oteracil potassium 250 mg/kg intragastrically to induce hyperuricemia model；1 h after modeling，treatment groups were given relevant medicine intragastrically，and normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 7 d.Blood uric acid，urine uric acid and 24 h creatinine levels，the expression of kidney transporter associated protein（mURAT1，mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2）were all determined in each group.RESULTS：Compared with normal group，blood uric acid，urine uric acid and mURAT1 levels of model group were significantly increased，while the expressions of mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2，24 h creatinine were significantly decreased（P＜0.01 or P＜0.001）.Compared with model group，blood uric acid，urine uric acid and mURAT1 levels of apigenin low-dose and high-dose groups，allopurinol group were significantly decreased，while 24 h creatinine，the expressions of mOCT1，mOCT2，mOCTN1 and mOCTN2 were increased significantly（P＜0.05 or P＜0.01 or P＜0.001）.CONCLUSIONS：Apigenin can reduce uric acid level of oteracil potassium-induced hyperuricemia mice and propect kidney，the mechanism of which may be associated with down-regulating the expression of mURAT1 and up-regulating the expressions of mOCTN1，mOCTN2，mOCT1 and mOCT2.

Apigenin；Hyperuricemia；Renal protection；Kidney transporter associated protein；Mechanism；Mice

R966

A

1001-0408（2016）34-4794-04

2016-06-13

2016-09-18）

（編輯：劉明偉）

中國(guó)藥科大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（No. ZJ16197）

＊講師，碩士。研究方向：藥動(dòng)學(xué)。電話：025-86185307。E-mail：mmx0224@cpu.edu.cn

#通信作者：主管藥師。研究方向：藥理學(xué)與藥房管理。電話：025-83304616。E-mail：20031269@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.13