鳶尾內(nèi)生真菌Fusariumoxysporum YW1的分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的研究

黃琪佳， 吳 敏， 黃玉瑩， 廖矛川， 楊光忠， 林親雄， 楊新洲

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院， 武漢 430074)

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鳶尾內(nèi)生真菌FusariumoxysporumYW1的分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物的研究

黃琪佳， 吳 敏， 黃玉瑩， 廖矛川， 楊光忠， 林親雄*， 楊新洲*

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院， 武漢 430074)

為了鑒定鳶尾(Iristectorum)內(nèi)生真菌YW1菌株并研究其活性代謝產(chǎn)物，通過菌株形態(tài)和其rDNA的ITS序列分析，鑒定其為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum);運(yùn)用薄層色譜、凝膠色譜和高效制備液相色譜方法從其代謝產(chǎn)物分離到5個(gè)生物堿類化合物，經(jīng)質(zhì)譜、核磁共振波譜技術(shù)鑒定為白僵菌素(1)，4-氧代-乙酰丙酸(2)，N-(4-氧代戊基)-乙酰胺(3)，5-丁基-2-吡啶羧酸(4)，5-丁烯-2-吡啶羧酸(5).生物活性測定結(jié)果表明化合物1對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有較強(qiáng)的抑菌活性.化合物1、4、5對HepG2和Hep3B細(xì)胞株具有一定的細(xì)胞毒活性，IC50值在65.3～120.5 μg/mL．

鳶尾; 內(nèi)生真菌; 尖孢鐮刀菌; 抗菌活性; 細(xì)胞毒活性;

植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌，被感染的宿主植物(至少是暫時(shí))不表現(xiàn)出外在癥狀，可通過組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離，或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生[1].藥用植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和廣泛的生物活性，是一類尚未被完全開發(fā)且極具潛力的藥物研發(fā)資源.近年來，從藥用植物內(nèi)生真菌中尋找新的生物活性成分已成為研究熱點(diǎn)[2]．

本研究小組在研究藥用植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的過程中，從一株藥用植株鳶尾(Iristectorum)的根部分離到一株內(nèi)生真菌YW1，前期研究顯示其發(fā)酵液含有明顯的生物堿代謝產(chǎn)物，對G+、G-細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑菌活性，對HepG2和Hep3B肝癌細(xì)胞有明顯的體外抗癌活性.為鑒定內(nèi)生真菌YW1并明確其生物活性成分，本研究通過形態(tài)特征和rDNA的ITS序列分析進(jìn)行了菌株的鑒定，采用薄層色譜、凝膠色譜和高效制備液相色譜方法，從YW1菌株發(fā)酵液中分離鑒定了多種生物堿成分，并對其抗菌與抗腫瘤活性進(jìn)行了評價(jià)．

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)器材

1.1.1鳶尾 于2014年8月采集于英山縣吳家山，經(jīng)中南民族大學(xué)劉新橋副教授鑒定為鳶尾(Iristectorum)．

1.1.2培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌分離及純化; MH培養(yǎng)基(杭州大和微生物試劑有限公司) 用于病原細(xì)菌培養(yǎng);RPMI 1640培養(yǎng)基(上海博升生物科技有限公司) 用于細(xì)胞培養(yǎng)．

1.1.3菌株與細(xì)胞株 金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus和大腸埃希氏菌Escherichiacoli，購自武漢大學(xué)微生物菌種保藏管理中心. HepG2、Hep3B肝癌細(xì)胞株，正常LO2肝細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.1.4試劑 氨芐青霉素和鏈霉素、五氟尿嘧啶、Sephadex LH-20 購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 甲醇、乙腈(色譜級(jí))( 美國Tedia 公司); 薄層目硅膠(200～300目，青島海洋化工廠) ; 其它試劑均為市售分析純.

1.1.5主要儀器 Q-TOF Micro LC-MS質(zhì)譜儀;Bruker DRX-500 MHz核磁共振儀;Waters 2535半制備制備型高效液相;Sunfire C18半制備柱(Waters，250 mm × 19 mm，5 μm);RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(IKA公司);C1000 touch PCR儀(Bio-Rad公司)．

1.2內(nèi)生真菌的分離純化

剪取鳶尾長約5 cm的側(cè)根清洗干凈，將一段側(cè)根在75%酒精中浸泡2 min，再用0.5%的次氯酸浸泡2 min，表面滅菌后用無菌水沖洗根須3次，用無菌濾紙吸干水分，在無菌條件下用解剖刀將側(cè)根切成0.5 cm長的小塊移接到PDA培養(yǎng)基(含氨芐青霉素和鏈霉素各100 mg/L)上，28℃培養(yǎng)7～14 d，將側(cè)根組織塊中長出的菌絲用PDA培養(yǎng)基連續(xù)重復(fù)純化3次.同時(shí)將另一段未進(jìn)行表面消毒不做剪切的側(cè)根置于PDA平板上作為對照，以此作為分離得到的真菌是否為植物內(nèi)生真菌的主要參考依據(jù). 分離菌株采用20%甘油低溫凍存，菌種保存于本實(shí)驗(yàn)室微生物菌種庫．

1.3真菌YW1菌株的鑒定

菌落形態(tài)觀察：將YW1菌株接種在PDA平板上培養(yǎng)10 d，連續(xù)觀察菌絲粗細(xì)、顏色、菌落形態(tài)等特征. 采用插片法顯微觀察菌絲、分生孢子、厚垣孢子等性狀， 并依據(jù)Boothcs鐮刀菌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定[3]．

核糖體ITS序列的測定：取YW1適量菌絲接于PDA液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩(160 r/min)培養(yǎng)5 d，過濾得菌絲體，用無菌水沖洗3次，冷凍干燥后備用.YW1菌株總DNA的提取方法參照文獻(xiàn)[4]，提取總DNA經(jīng)瓊脂糖電泳檢測合格后進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增與測序. ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4：5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3’由武漢擎科生物有限公司合成.PCR反應(yīng)體系包括：2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，5 U/μL的Taq酶0.4 μL，25 mmol/L的MgCl23 μL，5 μL的10×PCR Buffer(試劑由大連寶生物工程有限公司提供)，25 μmol/L的ITS1和ITS4各1 μL，10 ng的DNA模板，補(bǔ)足去離子水使總體積達(dá)到50 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行純化和測序．

1.4真菌YW1代謝產(chǎn)物的提取分離

YW1菌株活化后，用PDA液體培養(yǎng)基，28℃、160 r/min避光振蕩培養(yǎng)5 d，15 L發(fā)酵液用紗布過濾，濾液減壓濃縮5倍后，按體積比1∶1用石油醚萃取3次；菌體按1∶1的體積比加入丙酮，超聲2 h，減壓濃縮除去丙酮，菌體按體積比1∶1用石油醚加熱回流3次，合并石油醚萃取物，40℃真空減壓濃縮得到浸膏0.14 g.將石油醚處理后的菌液與菌絲，用乙酸乙酯同法處理，得到乙酸乙酯部位的浸膏1.5 g．

石油醚部位浸膏經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(φ2.5 cm × 150 cm)分離，TLC檢測合并得3個(gè)組分(Fr.1～Fr.3);Fr.1(90 mg)組分碘化鉍鉀顯橙黃色，采用制備型高效液相直接進(jìn)樣進(jìn)行分離，采用流動(dòng)相梯度洗脫(90%水∶10%乙睛→0%水∶100%乙睛，20 min，流速9.0 mL/min，水相含0.1%三氟乙酸，檢測波長254 nm)，得到化合物1(41.0 mg). 乙酸乙酯部位浸膏經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，TLC檢測合并得4個(gè)組分(Fr.1～Fr.4)， Fr.2(134 mg)組分碘化鉍鉀顯橙黃色，靜置溶劑揮發(fā)后析出玫瑰紅色的針狀結(jié)晶，再采用制備型高效液相直接進(jìn)樣進(jìn)行分離，流動(dòng)相梯度洗脫(條件同上，僅水相含0.2%三氟乙酸不同)，得到化合物4(21.2 mg)、化合物5(26.5 mg); Fr.3(110 mg)采用制備薄層(二氯甲烷∶甲醇∶甲酸=100∶5∶0.1)分離純化得到化合物2(6.1 mg)和3(8.5 mg)．

1.5化合物抗菌活性的測定

將冰箱保存的菌種用MH平板將其活化，接種到MH肉湯液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)4 h， 用0.9%生理鹽水稀釋200倍作為實(shí)驗(yàn)菌液．

將化合物用甲醇超聲溶解，用生理鹽水稀釋至30 μg/mL，控制甲醇的濃度低于50%，再用0.45 μm濾膜過濾，濾液為待測樣品溶液．

取200 μL上述菌液，均勻涂布于MH平板上，用滅菌打孔器在培養(yǎng)基上打直徑5 mm的孔，每孔加50 μL樣品液，每樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將加樣后的平板置于培養(yǎng)箱中，在37℃恒溫培養(yǎng)16 h，然后測定抑菌圈的大小，計(jì)算抑菌圈的平均值．

1.6MTT法測試化合物的抗肝癌活性

方法[5]取對數(shù)生長期HepG2、Hep3B、L-O2等3種細(xì)胞株， 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，每孔0.2 mL接種至96孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔添加含待測樣品的RPMI 1640培養(yǎng)液0.1 mL，使樣品濃度分別為10、20、40、100、2 002 g/mL，每濃度設(shè)3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對照、陰性對照和五氟尿嘧啶陽性對照，培養(yǎng)24 h、48 h后分別換液1次，培養(yǎng)72 h后，加入5 mg/mL的MTT 202 L繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0.15 mL DMSO，振搖30 min，充分溶解細(xì)胞內(nèi)生成的紫色甲臜結(jié)晶，于550 nm下測定每孔的A值，以下列公式計(jì)算化合物對細(xì)胞的生長抑制率：

生長抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%. 按文獻(xiàn)[6]計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)．

2結(jié)果與分析

2.1真菌YW1菌株的形態(tài)特征與鑒定

菌落在PDA培養(yǎng)基上，菌絲最初白色質(zhì)密，菌落呈突起絮狀，菌絲體具有條紋，呈絨毛狀，淺粉色至肉色，并帶有紫色，密被氣生菌絲(圖2)，菌落背面為紅色. PDA培養(yǎng)基插片培養(yǎng)顯微鏡觀察，可見大量大型分生孢子無色、多胞、鐮刀形、略彎曲、兩端細(xì)胞稍尖(圖3). 少數(shù)厚垣孢子淡黃色，近球形，表面光滑間生或頂生于孢子梗上. 菌落與孢子的形態(tài)特征與Boothcs鐮刀菌分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)基本一致．

YW1菌株ITS序列的GeneBank登錄號(hào)為KX262999. 在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST(http: //www. ncbi. nlm. nih. gov / blast /Blast. cgi) 分析，在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得ITS rDNA 序列與YW1菌株相近的菌株，計(jì)算YW1菌株與相近菌株的ITS序列的核苷酸差異值，以此進(jìn)行最大同源性排序，采用Neighbor-joining法基于rDNA ITS序列構(gòu)建與本菌株相近真菌種屬的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖3). 經(jīng)序列同源性比對分析，YW1菌株的rDNA ITS序列與Fusariumoxysporumisolate SPS-03 KM250373.1、Fusariumoxysporumstrain YuZhu1 KU512835.1菌株的序列同源性均為100%. 根據(jù)菌落形態(tài)與5.8S ITS rDNA序列分析的結(jié)果，YW1菌株可鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)．

圖1 YW1菌株在PDA平板上的菌落形態(tài)(左：菌落正面;右：菌落背面)Fig.1 Colony morphology of fungus YW1 on the PDA culture medium(Left: Colony front; Right: Back of the colony)

圖2 YW1菌株分生孢子的形態(tài)Fig.2 conidium morphology of fungus YW1

圖3 YW1菌株基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of fungus YW1 based on rDNA ITS sequence

2.2化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針狀結(jié)晶;ESIMSm/z: 784 [M+H]+;1H NMR (CDCl3， 500 MHz)δH: 7.13～7.26 (5H， m)， 5.44 (1H， dd，J=11.1， 4.1 Hz)， 4.92 (1H， d，J=8.6 Hz)， 3.35 (1H， dd，J=14.6， 5.0 Hz)， 2.97 (3H， s)， 2.96 (1H， dd，J=14.6， 11.8 Hz)， 2.01 (1H， m)， 0.77 (3H， d，J=6.7 Hz)， 0.43 (3H， d，J=6.8 Hz);13C NMR (CDCl3， 125 MHz)δC: 173.0 (C-1)， 57.9 (C-2)， 35.4 (C-3)， 138.0 (C-4)， 129.7 (C-5，9)， 129.8 (C-6，8)， 128.0 (C-7)， 31.2 (C-10)， 170.9 (C-11)， 77.2 (C-12)， 32.2 (C-13)， 19.0 (C-14)， 17.3 (C-15). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物一致[7]，故鑒定化合物1為白僵菌素(beauvericin)．

化合物2：無色油狀物;ESIMSm/z: 117 [M+H]+;1H NMR (CDCl3， 500 MHz)δH:2.77 (2H， t，J=6.4 Hz)， 2.54 (2H， t，J=6.4 Hz)， 2.20 (3H， s);13C NMR (CDCl3， 125MHz)δC:175.1 (C-1)， 27.4 (C-2)， 37.4 (C-3)， 208.4 (C-4)， 29.7 (C-5). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物一致[8]，故鑒定化合物2為4-氧代-乙酰丙酸(4-oxopentanoic acid)．

化合物3：無色固體;ESIMSm/z: 144 [M+H]+;1H NMR (CD3OD， 500 MHz)δH:3.14 (2H， t，J=7.0 Hz)， 2.52 (2H， t，J=7.2 Hz)， 2.13 (3H， d，J=3.2 Hz)， 1.92 (3H， d，J=3.3 Hz)， 1.72 (2H， t，J=7.1 Hz);13C NMR (CDCl3， 125 MHz)δC:21.1 (C-1)， 172.0 (C-2)， 38.3 (C-4)， 23.1 (C-5)， 39.9 (C-6)， 209.6 (C-7)， 28.4 (C-8). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物一致[9]，故鑒定化合物3為N-(4-氧代戊基)-乙酰胺(N-(4-oxopentyl)-acetamide)．

化合物4：無色結(jié)晶;ESIMSm/z: 180 [M+H]+;1H NMR (CDCl3， 300 MHz)δH: 8.66 (1H， d，J=2.5 Hz)， 8.18 (1H， d，J=8.0 Hz)， 7.79 (1H，dd，J=8.0， 2.0 Hz)， 2.75 (2H， t，J=7.5 Hz)， 1.66 (2H， m，J=7.5 Hz)， 1.38 (2H， m，J=7.5 Hz)， 0.94 (3H， t，J=7.5 Hz， );13C NMR (CDCl3， 125 MHz)δC: 145.4 (C-2)， 124.7 (C-3)， 138.4 (C-4)， 142.9 (C-5)， 148.0 (C-6)， 32.7 (C-7)， 32.1 (C-8)， 21.9 (C-9)， 12.7 (C-10)， 165.8 (C-11). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物一致[10]，故鑒定化合物4為5-丁基-2-吡啶羧酸(5-butyl-2-pyridinecarboxylic acid)．

化合物5：無色結(jié)晶;ESIMSm/z: 178 [M+H]+;1H NMR (CDCl3， 300 MHz)δH:8.51 (1H， d，J=1.2 Hz)， 8.10 (1H， d，J=7.8 Hz)， 7.88 (1H， dd，J=7.8， 1.2 Hz)， 5.84 (1H， m)， 5.00 (2H， q)， 2.84 (2H， t，J=7.5 Hz)， 2.43 (2H， q，J=6.6 Hz);13C NMR (CDCl3， 125 MHz)δC:145.5 (C-2)， 124.7 (C-3)， 138.5 (C-4)， 142.0 (C-5)， 148.2 (C-6)， 31.7 (C-7)， 34.4 (C-8)， 136.7 (C-9)， 116.0 (C-10)， 165.7 (C-11). 其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物一致[10]，故鑒定化合物5為5-丁烯-2-吡啶羧酸(5-butylene-2-pyridinecarboxylic acid)．

化合物的結(jié)構(gòu)式如圖4所示．

圖4 化合物1～5的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.4 Chemical structures of compounds 1～5

2.3化合物的抑菌與細(xì)胞毒活性

抗菌活性測定結(jié)果表明：化合物1(白僵菌素)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有較強(qiáng)的抗菌活性，30 μg/mL的化合物1對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌圈直徑分別為1.8 cm、1.5 cm．

MTT法測定結(jié)果(如表1)顯示，化合物1、4、5對HepG2和Hep3B兩個(gè)細(xì)胞株均顯示弱的抗癌活性，其抗肝癌活性IC50值范圍在65.3～120.5 μg/mL之間，但對正常LO2細(xì)胞毒性很小．

表1 化合物1～5細(xì)胞毒活性結(jié)果(IC50， μg/mL; mean ± SD， n=3)

a5-氟尿嘧啶作為陽性對照．

3結(jié)果與討論

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是一類既可侵染植物又可在土壤內(nèi)生存的兼性寄生真菌.和其它植物病原菌一樣，存在著種下分化，可侵染許多植物寄主，具有多種專化型[11].有研究報(bào)道從銀杏、黃山石杉、椴樹、粉背薯蕷、重陽木、長梗黃精中分離到尖孢鐮刀菌[12].本研究從鳶尾植株根部分離到該菌尚屬首次報(bào)道．

本研究首次從鳶尾內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)次級(jí)代謝產(chǎn)物中提取分離得到白僵菌素，該化合物最早在真菌Beauveriabassiana菌絲體中發(fā)現(xiàn)[4]，它是脂肽類化合物，具有殺蟲、膽甾醇酰基轉(zhuǎn)移酶抑制(與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高膽固醇血癥相關(guān))、腫瘤細(xì)胞毒和引發(fā)細(xì)胞程序性凋亡等作用[13-14]. 白僵菌素對人體和動(dòng)植物病原菌也有很強(qiáng)的抗菌活性，且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌無選擇性[15].目前，國內(nèi)外研究對白僵菌素的抗菌活性報(bào)道較多，可是對其抗菌機(jī)制報(bào)道較少，課題組將對其抗菌機(jī)制進(jìn)行深入的研究．

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Study on isolation and taxonomy determination of the endophytic fungusFusariumoxysporumYW1 fromIristectorumand its secondary metabolites

HUANG Qijia， WU Min， HUANG Yuying， LIAO Maochuan，YANG Guangzhong， LIN Qinxiong， YANG Xinzhou

(College of Pharmacy， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074)

To identify endophytic fungi YW1 strains fromIristectorumand determine its active metabolites， the fungus YW1 was classificated asFusariumoxysporumbased on morphological features and its sequence. Five alkaloid compounds were isolated from the its fermentation broth by thin layer chromatography， Sephadex LH-20 gel column chromatography and preparative HPLC， and elucidated as beauvericin (1)， 4-oxopentanoic acid (2)， N-(4-oxopentyl)-acetamide (3)， 5-butyl-2-pyridinecarboxylic acid (4)， and 5-butylene-2-pyridinecarboxylic acid (5) by means of MS and NMR. The results of biological activity assay showed that compound 1 had strong antibacterial activities against Staphylococcus aureus and Escherichia coli， and compounds 1， 4 and 5 exhibited weak cytotoxic activities against HepG2 and Hep3B cell withIC50range of 65.3～120.5 μg/mL.

Iristectorum; endophytic fungi;Fusariumoxysporum; antibacterial activity; cytotoxic activity

2016-05-28.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81573561,31560010).

1000-1190(2016)06-0880-06

Q819

A

*通訊聯(lián)系人. 林親雄，E-mail: linqinxiong@mail.scuec.edu.cn; 楊新洲， E-mail: xzyang@mail.scuec.edu.cn．