應用微陣列比較基因組雜交技術產前檢測室間隔缺損胎兒2p16.3微缺失的臨床研究*

王紅丹，馮戰啟，婁桂予△，劉紅彥，黃飛飛，劉石嶺

(1.鄭州大學人民醫院/河南省人民醫院醫學遺傳研究所，鄭州 450003；2.河南省鄭州市第一人民醫院泌尿外科 450004)

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·經驗交流·

應用微陣列比較基因組雜交技術產前檢測室間隔缺損胎兒2p16.3微缺失的臨床研究*

王紅丹1，馮戰啟2，婁桂予1△，劉紅彥1，黃飛飛1，劉石嶺1

(1.鄭州大學人民醫院/河南省人民醫院醫學遺傳研究所，鄭州 450003；2.河南省鄭州市第一人民醫院泌尿外科 450004)

目的 了解心臟室間隔缺損胎兒基因組拷貝數變化，尋找其致病的遺傳學基礎，探討微陣列基因組雜交技術在產前診斷中應用的可行性。方法 用G顯帶核型分析技術分析胎兒及其父母外周血染色體，用微陣列比較基因組雜交技術(Array-CGH)進行患兒及其父母DNA拷貝數變異分析，經數據庫比對和文獻分析明確異常缺失區域的病理意義。結果 患兒父母外周血染色體核型分析未見異常；Array-CGH檢測患兒發現染色體2p16.3區存在640×103bp的缺失，15q11區存在2 028×103bp的缺失，20p13區存在535×103bp的重復。結論 經查數據庫及相關文獻發現染色體2p16.3區域微缺失可能與胎兒室間隔缺損相關。

產前診斷；核酸雜交；基因組；可行性研究；微陣列比較基因組雜交；室間隔缺損

微陣列比較基因組雜交技術(Array-CGH)具有高分辨率、高通量、高靈敏性和高準確性。本研究應用Array-CGH對1例室間隔缺損的先天性缺陷胎兒羊水細胞進行高分辨率全基因組掃描分析，旨在尋找胎兒基因組中可能存在的病理性拷貝數變異(copynumbervariations,CNVs)，豐富對室間隔缺損的病因學認識，探討微陣列比較基因組雜交在產前分子細胞遺傳學診斷中應用的可行性，為患兒父母再生育選擇合適的產前診斷技術提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 孕婦，漢族，31歲。晚孕，因超聲檢查發現胎兒室間隔缺損至河南省人民醫院醫學遺傳研究所行產前遺傳咨詢?；颊吲c其配偶體檢正常，非近親結婚，無遺傳家族史。為明確病因，經患者知情同意，進行了羊水穿刺術并抽取胎兒父母外周血進行細胞和分子遺傳學檢測。此項研究經過河南省人民醫院醫學倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞遺傳學核型分析 抽取胎兒父母靜脈血各3mL，均肝素抗凝處理，取1mL接種于RPMI1640淋巴細胞培養液中進行培養，置于恒溫箱37 ℃培養72h，收獲前1h加入秋水仙素。常規細胞收獲，制片，Giemsa染色顯帶，選擇分散良好和顯帶清晰的核型鏡下進行計數分析。

1.2.2DNA提取 取500μL血液，采用全血DNA柱式提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)按照說明書操作進行。超微量分光光度計(NanoDrop2000，美國)測定DNA濃度和純度，所提DNA樣本A260/A280為1.80～1.90。

1.2.3Array-CGH檢測分析 對患兒及其父母應用HumangenomeCGHMicroarray8×60K芯片(美國Agilent公司)進行檢測，采用MicroarrayScanner(美國Agilent公司)及其他配套軟件對芯片進行掃描和初步分析，檢索UCSC、DECIPHER、ISCA等數據庫對芯片實驗結果進行進一步的及對比致病性鑒定。

1.2.4CNVs的判斷和評價 基因組CNVs分析采用AgilentSurePrintG3HumanCGHMicroarrayKit，該芯片包含約6萬個拷貝數標記探針。研究表明，致病的CNVs99.34%片段大于300×103bp[1]，臨床應用中建議針對200×103bp以上CNVs進行檢測[2]。本檢測僅針對染色體非整倍體性改變及200×103bp以上的片段缺失與重復，不排除有更小的染色體結構或基因片段異常的可能性。根據CNVs的性質不同可將其分為良性CNVs、可疑致病性CNVs及臨床意義不明確的CNVs(variantsofuncertainsignificance,VOUS)。數據分析參考公開數據庫UCSC、DECIPHER、ISCA等。

2 結 果

2.1 細胞遺傳學檢測結果 胎兒及其父母染色體核型正常。

2.2Array-CGH檢測結果 胎兒Array-CGH檢測發現2個微小缺失和1個微小重復，缺失發生在2p16.3區(hg19：52185415-52825075)和15q11區(hg19：20481702-22509254)，大小分別為640×103bp和2 028×103bp，檢測核型圖見圖1；重復發生在20p13區(hg19：439387-974841)，大小約535×103bp。未見其他染色體存在探針拷貝數變化。其父母Array-CGH檢測未發現拷貝數變化。

圖1 Array-CGH檢測核型圖

3 討 論

Array-CGH技術通過一次雜交試驗就可以對全基因組DNACNVs進行檢測，又被稱為“分子核型分析”，具有高分辨率、高敏感性和高準確性等優點，對于檢測染色體組微小缺失、重復等不平衡性重排具有獨特優勢，明顯提高了基因組不平衡的檢測率。2010年，國際細胞基因組芯片標準協作組(ISCAConsortium)推薦將Array-CGH作為對原因不明的發育遲緩、智力低下、多種體征畸形及自閉癥患者的首選臨床一線檢測方法[1]。

染色體異常是先天發育畸形、發育遲緩和其他多種先天異常的主要原因。其中較小染色體不平衡畸變也可以引起智力低下、器官畸形和生長發育遲緩。而常規G顯帶技術對這些較小染色體不平衡畸變的檢出率僅15%～40%[2]。目前，國外研究已經證實Array-CGH在針對智力低下、多發性先天畸形等患者的遺傳診斷中的檢出率為7%～11%[3-4]。染色體微缺失或重復引起的綜合征常見的有Williams綜合征、DiGeorge或velo-eardio-facial綜合征及Prader-Willi綜合征等，其引起的傷殘程度及其給家庭、社會造成的負擔嚴重[5]。而導致這些綜合征的染色體異常片段通常比較細小，因此往往不能被常規方法識別。

先天性心臟病(congenitalheartdefect,CHD)是最常見的先天缺陷，發生率為活產兒的1%和自然流產的10%[6]，其中染色體異常占其發生原因的8%，環境因素占2%，余為多因子因素引起[7]。報道最多的引起CHD的微缺失發生在22q11基因群，發生率1.4～2.5%[8-10]。許爭峰等[11]對163例的CHD進行研究發現7.36%CHD存在22q11關鍵區微缺失。另據報道，與胎兒心臟正常發育密切相關的還有5q35區段、心臟特異性同源盒基因及Jagged1基因等[12]。

本例Array-CGH檢測胎兒發現染色體2p16.3區域存在640×103bp的缺失(hg19：52185415-52825075)，15q11區域存在2 028×103bp的缺失(hg19：20481702-22509254)，20p13區域存在535×103bp的重復(hg19：439387-974841)。經查閱公開數據庫UCSC、DECIPHER、ISCA等未見染色體15q11區域2 028×103bp缺失和20p13區域535×103bp重復的致病性報道，且在健康人群中存在這兩種CNVs。而數據庫顯示2p16.3區域缺失與智力障礙、癲癇、語言發育障礙、面部發育畸形等多種臨床特征相關，但未見該區域與室間隔缺損相關性的報道，本例發現該缺失區段也與室間隔缺損相關，豐富了數據庫信息。關于該區域致病的文獻報道也很多，Meng等[13]的研究顯示該區域的突變可能與原發性青光眼相關，Zhen等[14]的研究顯示該區域可能與生育相關，另有研究顯示該區域的微缺失與發育遲緩、身材矮小和先天性膈疝等相關[15]。

總之，應用Array-CGH，在一個室間隔缺損的胎兒基因組中檢出了一個未報道過的染色體2p16.3新發缺失，明確診斷了本病例2p缺失的斷裂位點、片段大小乃至基因序列，也為臨床表型與基因型關系的研究提供了較為完整的信息。2p16.3區域缺失具有多種臨床特征，臨床特征的可辨識性不高，如果明確診斷仍需要分子細胞遺傳學實驗分析，該缺失與疾病表型的相關性還有待于進一步研究去澄清。

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國家自然科學基金資助項目(81501336，81270488)。 作者簡介：王紅丹(1983-)，助理研究員，碩士，主要從事生殖醫學方面研究?！?/p>

E-mail：louguiyu@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.23.030

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1671-8348(2016)23-3256-02

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