平貝黑腐病發生的土壤微生態機制及拮抗細菌初步篩選*

宋小雙 遇文婧 周 琦 鄧 勛

（黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱 150040）

平貝黑腐病發生的土壤微生態機制及拮抗細菌初步篩選*

宋小雙 遇文婧 周 琦 鄧 勛*

（黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱 150040）

采用土壤微生物學和植物病理學研究方法，以平貝黑腐病發病植株和健康植株根區土壤為研究對象，研究土壤養分、微生物區系組成同平貝黑腐病發生的相關性，并對健康植株根區土壤中黑腐病病原菌的高效拮抗細菌進行了初步篩選。結果表明：根區土壤pH值下降，鹽分含量提高及土壤有機質與速效磷、鉀供給不足等可導致黑腐病發生；平貝根區土壤微生物區系組成及其多樣性的變化，尤其是真菌數量的上升是平貝黑腐病發生的主要原因；分離篩選得到3株可顯著抑制黑腐病病原菌生長的細菌菌株，其中菌株SF013對病原菌生長抑制作用最好，對峙培養和發酵液抑菌率分別為79.11%和85.19%。

平貝黑腐病；系統發病機制；生防細菌篩選

平貝黑腐病(Sclerotinia sclerotiorum)是平貝最重要的病害，又名菌核病，屬于土傳病害，以土壤為媒介進行傳播，嚴重可導致平貝絕產[1]。目前，黑龍江省森工林區平貝栽培已有30多年的歷史，主要采取連作模式，有關研究表明，連作條件下作物土傳病害的發生與根際土壤微生物區系發生異常變化密切相關[2]，而土壤微生物區系和養分的變化是土傳病害發生的主要原因[3-7]，但目前平貝根腐病發生的微生態機制還沒有相關報道。因此本文通過對平貝黑腐病發病植株和健康植株土壤微生物區系及養分的比較研究，揭示平貝黑腐病發生的微生態機制，同時篩選平貝健康植株根際土壤中的高效拮抗細菌菌株，旨在為平貝黑腐病的微生態調控修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 研究區概況

試驗地位于牡丹江市海林林業局三十五林場平貝栽培基地（44°52′41.89″N，129°19′40.92″E），平貝種植面積2.78 hm2，始栽于1980年，為多年連作栽培模式。該地區年有效積溫2 400℃，全年日照時數2 540 h，年平均降水量550 mm，無霜期125天左右。近年平貝黑腐病、灰霉病發生嚴重，發病率50%以上。

1.1.2 采樣時間及方法

于2014年5月，在三十五林場平貝栽培地，分別采集平貝健康和發病地塊的土壤樣品。土壤采集深度為5～10 cm，隨機取5個點采集后混合，裝入自封袋中帶回實驗室進行分離。

1.1.3 培養基

細菌、真菌和放線菌所用培養基分別為牛肉膏蛋白胨培養基（BPA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）和高氏一號培養基（GA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 發病與健康地塊土壤養分分析

土壤pH值采用電位法，可溶性鹽分采用蒸干法，有機質采用重鉻酸鉀容量法，土壤銨態氮采用氯化鉀浸提靛酚藍比色法，速效磷用碳酸氫鈉浸提鉬銻抗比色法，速效鉀用醋酸銨浸提火焰光度法測定[8]。

1.2.2 發病與健康地塊土壤微生物區系的測定

土壤微生物計數采用土壤稀釋后平皿涂抹法[9]，對供試土壤樣品中的細菌、放線菌和真菌進行計數，每處理設3個稀釋度，每個稀釋度設3個重復，涂平板后，在操作臺中用無菌風吹干平板，置于28℃培養。完成計數統計后，進行土壤微生物多樣性計算，包括微生物多樣性Shannon-Wienner指數（H）、豐富度指數（S）、均勻度Pielou指數（J）。

1.2.3 平貝黑腐病拮抗細菌的初步篩選

分別采用平板對峙培養法和發酵液抑菌實驗[10-12]，測定平貝健康地塊根區土壤細菌對平貝黑腐病病原菌的抑制作用，以普通平板為對照，測定菌落直徑，按公式計算抑菌率，篩選高效拮抗細菌菌株。

1.2.4 數據處理

試驗數據采用進行方差分析，平均數按新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 發病與健康地塊土壤養分分析

通過測定土壤pH值、鹽分、有機質、銨態氮、速效磷和速效鉀6個指標來比較分析平貝黑腐病發病與健康地塊土壤化學性質的差異（表1），通過方差分析結果表明：發病和健康地塊測定的土壤指標均存在顯著性差異（P＜0.05），其中發病地塊土壤鹽分和銨態氮分別提高37.28%和12.72%，而有機質、速效磷和速效鉀分別降低19.38%、23.61%和32.72%，說明平貝根區土壤中養分的變化，如有機質與速效磷鉀供給不足、鹽分含量大幅提高及pH下降等土壤化學性質變化是導致平貝黑腐病發生的微生態因素之一。

表1 平貝黑腐病發病地塊與健康地塊土壤養分分析

2.2 發病與健康地塊土壤微生物區系的分析

基于土壤微生物數量組成和多樣性分析，同平貝健康植株地塊土壤相比，微生物數量存在顯著性差異（P＜0.05），平貝黑腐病發病地塊土壤細菌、真菌數量分別提高113.15%和68.43%，而放線菌數量降低39.67%（表2）。上述結果表明：平貝健康植株與發病植株根區土壤微生物數量發生變化，其中細菌數量增加與平貝鱗莖發生不同程度腐爛導致組織分解液外滲、土壤營養條件改變、細菌大量生長繁殖有關，而真菌數量增加與土壤微生態環境破壞、平貝黑腐病原真菌大量繁殖有關。

表2 平貝黑腐病發病地塊與健康地塊微生物數量

發病土壤細菌和真菌的多樣性指數H、豐富度指數S、均勻度指數J均低于健康土壤（表3），也反映發病土壤中微生物數量呈現單一化趨勢。同微生物數量結合分析可知：平貝黑腐病發病地塊病原真菌過量繁殖，導致微生態系統破壞，是土傳病害發生的根本原因。

表3 平貝黑腐病發病地塊與健康地塊土壤微生物多樣性（H）、豐富度（S）、均勻度指數（J）指數分析

2.3 平貝黑腐病高效拮抗細菌的初步篩選

通過對峙培養和發酵液抑菌實驗，初步篩選得到9株對平貝黑腐病病原菌有抑制作用的細菌菌株（表4），不同菌株對病原菌的抑制作用存在顯著性差異（P＜0.05），其中菌株SF013對病原菌生長抑制作用最好，對峙培養和發酵液抑菌率分別為79.11%和85.19%，其次為菌株SF007，對峙培養和發酵液抑菌率分別為77.85%和79.12%，菌株SF003的對峙培養和發酵液抑菌率分別為60.15%和65.25%，對病原菌生長也具有抑制作用。

表4 抑菌率

3 結論

3.1 平貝黑腐病發病與健康植株根區土壤化學性質存在顯著差異。

3.2 平貝黑腐病的發生與根區土壤pH值下降，鹽分含量提高及土壤有機質與速效磷、鉀供給不足等土壤化學性質發生變化有關。

3.3 平貝黑腐病發病與健康植株微生物區系也存在顯著差異。發病植株根區土壤中細菌與真菌數量同健康植株相比顯著提高，同時微生物多樣性、豐富度和均勻度指數均降低，微生物群落結構趨于真菌主導型。

3.4 平貝根區土壤微生態系統中土壤化學性質及根區微生物區系組成及其多樣性的變化是平貝黑腐病發生的主要原因，在分析發病微生態機制基礎上，測定了健康平貝植株根區土壤細菌對平貝黑腐病菌的抑制作用，篩選得到3株具有生防潛力的細菌菌株，為平貝黑腐病的微生態調控打下良好基礎。

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［12］劉春來,李新民,王爽,等.土壤拮抗細菌的分離與抗植物病原真菌活性初步研究［J］.黑龍江農業科學,2015(07):56 -61.

第1作者簡介：宋小雙（1977-），女，副研究員，博士，主要研究方向：生物防治及生防菌劑研發。通訊作者：鄧勛（1978-），男，研究員，博士，主要

（責任編輯：李丹）

Microbial Ecological Study about the Black Rot of Fritillaria ussuriensis and Its Biological Control Bacteria Screening

SONGXiaoshuang
（Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy,Harbin150081）

Black rot is the most important disease for Fritillaria ussuriensis,In this paper,the root-zone soil of the healthy and disease plant are studied by the method of soil microbiology and plant pathology to understand the micro ecological mechanism of Fritillaria ussuriensis black rot disease,and then screened the biological control bacteria.The results showed that:1)pH value decreased,increase in salt content,soil organic matter and available phosphorus and potassium of root-zone soil,can lead to the occur of black rot disease.2)The composition and diversity of root-zone soil microbial flora,especially the increase of the number of fungi was the main reason for the occurrence of black rot disease.3)Three biological control bacteria were screened by dural culture and fermentation broth inhibition test,in them the strain SF013 have the best inhibition effect,the inhibition rate of dural culture and fermentation broth inhibition test are 79.11% and 85.19%respectively.

Black Rot of Fritillaria ussuriensis;System pathogenesis;Biological control bacteria screening

S567.23+1,S436.631+4

A

1001-9499（2016）06-0018-03

菌物開發利用及林木病害可持續控制。

2016-08-11

*黑龍江省森工總局項目（SGZJY2012016，SGZJY2010014）;國家自然科學基金項目（31200484，31170597）