早期生長反應-1蛋白和第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因在老年垂體瘤中的表達及其臨床意義

黨 帥 張 強 張躍欣 馬進顯

(南陽市中心醫院神經外科，河南 南陽 473009)

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早期生長反應-1蛋白和第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因在老年垂體瘤中的表達及其臨床意義

黨 帥 張 強1張躍欣 馬進顯

(南陽市中心醫院神經外科，河南 南陽 473009)

目的 探討早期生長反應(Egr)-1蛋白和第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(PTEN)在老年垂體瘤中的表達和意義。方法 回顧性收集25例病理學診斷為非侵襲性垂體瘤，10例診斷為侵襲性垂體瘤的老年患者垂體瘤病理組織學樣本及35例正常垂體組織標本。免疫組化法SP法檢測Egr-1和PTEN在老年垂體瘤中的表達，并分析其意義。結果 35例老年性垂體瘤患者組織標本Egr-1 和PTEN水平明顯增高，與健康垂體組織差異具有統計學意義(P<0.05)；侵襲性垂體瘤中Egr-1水平明顯高于非侵襲性垂體瘤(P<0.05)；與非侵襲性垂體瘤相比，侵襲性垂體瘤PTEN的表達明顯降低(P<0.05)。結論 Egr-1和PTEN兩者聯合檢測對評價老年垂體瘤的預后有重要作用。

早期生長反應(Egr)-1蛋白；第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(PTEN)；老年垂體瘤

臨床上有明顯癥狀的垂體瘤患者約占顱內腫瘤的10%〔1〕。臨床表現為激素分泌異常、腫瘤壓迫垂體周圍組織、垂體腦卒中和其他垂體前葉功能減退表現〔2〕。早期生長反應(Egr)-1是一種Egr基因-1編碼的蛋白質，目前認為，Egr-1在調節早期垂體的增殖、分化、凋亡、胚胎發育及多種良性及惡性腫瘤的發生、發展過程中起重要作用，包括生殖器腫瘤，消化系統腫瘤中等〔3～5〕。第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(PTEN)是近年來新發現的多種抑制垂體增殖相關基因之一〔6～8〕。本研究探討二者在垂體瘤發生發展中的作用及其可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年1月至2015年9月回顧性收集我院神經外科就診的35例經病理確診為老年垂體瘤的患者，其中病理學診斷為非侵襲性垂體瘤25例，侵襲性垂體瘤10例，男20例，女15例，年齡(62.3±15.7)歲。同時術中留取瘤旁正常垂體組織。已經過本院醫學倫理委員會批準同意。納入標準：①需經過病理診斷確診老年性垂體瘤；②無合并其他部位及組織器官的原發性或繼發性良惡性腫瘤；③均為首次確診；④知情同意。排除標準：①患者及患者家屬不能配合檢查；②患者拒絕接受病理檢查；③患者拒絕接受治療；④切取病理組織前3～4 w內曾經接受化療、放療、靶向治療及免疫調節治療；⑤有精神疾病或意識障礙。

1.2 實驗試劑 0.9%無菌生理鹽水(大冢制藥，日本)，鼠抗人Egr-1抗體(博士德生物，武漢)，鼠抗人PTEN抗體(博士德生物，武漢)，免疫組化SP 900染色試劑盒和二氨基聯苯胺(DAB)濃縮型染色試劑盒及Mayer蘇木素(中杉金橋，北京)，新鮮二甲苯和35%乙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉(天津化學試劑三廠)等。

1.3 實驗儀器 微量移液器、海爾制冰機，4℃恒溫冰箱，10 ml注射器，5 ml注射器(哈那好，天津)，病理切片機(Leica，德國)EP管(Eppendorff，德國)，水浴鍋(北京醫療器械廠)，顯微照相機和光學顯微鏡(OLYMPUS，日本)等。

1.4 病理取材方法 有執業醫師資格的臨床醫師對疑似病變的垂體瘤組織進行完全切除的方式。切取后標本需立刻放在提前準備好的4%多聚甲醛溶液的容器中，并由我院病理科包埋切片，采用連續切片的方法，設置厚度 5 μm，展片，貼片，并記錄好患者姓名，病歷號，取材時間及取材組織類型后，放入60℃烤箱中1 h，使組織緊密附著玻片，從烤箱中取出標本，并冷卻至室溫，置入4℃冰箱備用。

1.5 免疫組化SP法〔6〕在免疫組化染色之前，首先需要進行待測病理組織的石蠟切片制作。95℃檸檬酸鈉溶液中抗原修復后，使用正常山羊血清封閉液進行封閉處理。辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(羊抗兔Egr-1/PTEN單克隆抗體)處理，使用DAB復染后，蘇木素復染封片，鏡檢。

1.6 老年性垂體瘤免疫組化染色結果判讀方法〔7〕(1)檢測陽性：Egr-1和PTEN基因表達產物蛋白陽性主要集中在垂體瘤細胞核中。染色后，在光學顯微鏡下可以見到，垂體核深染棕色或棕褐色的顆粒，即陽性垂體。(2)垂體計數：用每平方毫米陽性垂體數表示。根據觀測到的Egr-1和PTEN陽性垂體的比例(PP)和染色強度(SI)進行評分。(3)評分標準：總分值=SI×PP，總分值≤6和>6分別定義為陰性和陽性。依照垂體染色強度可分為 4 級：評分標準：總分值=SI×PP，總分值≤6 和>6 則分別認為檢測陰性和陽性。依照垂體染色強度可分為以下4級：①未見垂體著色為陰性0分；②弱陽性(+)1分；③中等陽性()為2分；④強陽性()3分。 按照PP分為4級：①陰性：未見垂體染色0分；②陽性垂體數≤10%為1分；③陽性垂體數11%～50%計2分;④陽性垂體數為 51%～80%計為3分;⑤陽性垂體數>80%計為4分。標本陽性率由陽性標本數之和占總標本數的百分率來計算。采用低倍和高倍鏡下觀察，在高倍鏡下(400×)隨機選擇10個視野，計算陽性垂體所占的百分率，即表達強度。

1.7 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行方差分析(ANOVA)檢驗，T檢驗和χ2檢驗，不滿足條件者的四格表數據采用Fisher精確概率法，定量數據比較使用方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1 各組Egr-1和PTEN在組織中陽性率 與正常垂體組織比較，老年性垂體瘤Egr-1和PTEN的陽性率明顯增高(P<0.01)。與正常垂體組織比，Egr-1在侵襲性垂體瘤組織(χ2=31.67)和非侵襲性垂體瘤組織(χ2=15.68)均明顯增高(P<0.05)，PTEN在侵襲性垂體瘤組織(χ2=41.14)和非侵襲性垂體瘤組織(χ2=20.09)明顯降低(P<0.05)，Egr-1(χ2=0.9)和PTEN(χ2=1.6)在侵襲性垂體瘤組織和非侵襲性垂體瘤組織無顯著差異(P>0.05)。見表1、圖1和圖2。

表1 Egr-1和PTEN基因在所取得的組織標本中的陽性率比較〔n(%)〕

分組nEgr-1PTEN侵襲性垂體瘤組織2519(76.0)3(12.0)非侵襲性垂體瘤組織106(60.0)3(33.3)正常垂體組織352(6.06)33(94.3)χ2/P值32.67/0.00743.15/<0.001

圖1 各組Egr-1表達情況(SP，×400)

2.2 各組Egr-1 和PTEN的表達強度 與正常垂體組織相比，垂體瘤組織Egr-1和PTEN的表達強度差異均顯著(P<0.05)，與正常垂體組織比，Egr-1在侵襲性垂體瘤組織(t=18.50)和非侵襲性垂體瘤組織(t=19.14)均明顯增高(P<0.05)，PTEN在侵襲性垂體瘤組織(t=24.51)和非侵襲性垂體瘤組織(t=14.95)明顯降低(P<0.05)，與非侵襲性垂體腫瘤組比，侵襲性垂體瘤組的Egr-1(t=4.96)表達強度明顯增高(P<0.05)，PTEN(t=15.67)表達強度明顯降低(P<0.05)。見表2。

分組nEgr-1PTEN侵襲性垂體瘤組織257.21±2.30.02±0.01非侵襲性垂體瘤組織104.62±1.40.27±0.8正常垂體組織350.01±0.0058.52±1.7t/P值8.44/0.012409.18/0.001

3 討 論

垂體瘤是常見的顱內腫瘤，人群中發病率約1/10萬，僅次于神經表皮性腫瘤和腦膜瘤〔7～9〕。目前在垂體瘤的診斷中，病理診斷仍然是金標準〔10〕，有時借助B超，CT等影像學檢查及經鼻內鏡等方法作為判斷遠處侵襲性的方法〔11〕。

研究認為Egr-1〔12〕，PTEN〔13〕等可以作為老年垂體瘤診斷的標志物，尤其在評價惡性腫瘤的侵襲性及預后方面，既往報道在宮頸癌中，早期PTEN水平明顯增高，但隨著惡性程度的增加，PTEN 水平明顯降低〔14〕。PTEN 可以通過與酪氨酸激酶競爭共同的底物而發揮作用，是一種腫瘤抑制因子。可以通過阻止垂體生長，有絲分裂等方式發揮調節作用〔15〕。在人的實體腫瘤中，尚未得到證實。Egr-1〔16〕編碼的蛋白結構是一個擁有3個重復鋅指結構域的蛋白，在介入外界信號與靶基因耦聯中發揮作用。在包括老年垂體瘤在內的多種惡性腫瘤中明顯增高，但其增高的程度與腫瘤的發生發展及分化程度無明顯相關〔17〕。在垂體瘤發生的早期，由于受到各種理化因素的影響，體內Egr-1基因被激活，并進一步促進癌變發生，同時，作為平衡杠桿的抑癌基因PTEN也被激活，通過抑制腫瘤垂體有絲分裂等方式，抑制了腫瘤垂體的增殖及遠處侵襲性，但隨著病變的進展，由于體內各種信號通路以及炎癥因子的釋放，致使的原癌基因被激活，其中可能包含某些可以抑制PTEN信號通路的基因，這就使得抑癌基因PTEN的保護作用減弱，促進腫瘤發生遠處侵襲，但這一猜測仍需要進一步的理論實驗證實。 綜上，在老年垂體瘤患者中，Egr-1和PTEN水平均比健康人明顯增高，二者結合對于診斷垂體瘤患者可能發生的潛在侵襲性具有重要作用，在指導臨床手術及化療方案中具有重要意義。

1 Albert B，Lauri A, Adrian FD，etal.Familial isolated pituitary adenomas (FIPA)and the pituitary adenoma predisposition due to mutations in the Aryl hydrocarbon receptor interacting protein (AIP)gene〔J〕.Endocr Rev，2013；34(2)：239-77.

2 Ines D，Ren SG，Tamar E，etal.Sca1-positive murine pituitary adenoma cells show tumor growth advantage〔J〕.Endocr Relat Cancer，2014；21(2)：203-16.

3 Zhu XM，Wang YF，Zhao XL，etal.Incidence of pituitary apoplexy and its risk factors in Chinese people：a database study of patients with pituitary adenoma〔J〕.PLoS One，2015；10(9)：e0139088.

4 Zhou YL，Zhang X，Kibanski A.Genetic and epigenetic mutations of tumor suppressive genes in sporadic pituitary adenoma〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2014;386(1-2):16-33.

5 Xiao JQ，Liu XH，Hou B，etal.Correlations of pituitary tumor transforming gene expression with human pituitary adenomas：a meta-analysis〔J〕.PLoS One，2014；9(3)：e90396.

6 Anthony PH.Pituitary carcinoma：difficult diagnosis and treatment〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2011；96(12)：3649-60.

7 Nestoras M，Ram S，Alexandra L，etal.Expression of the pituitary stem/progenitor marker GFRα2 in human pituitary adenomas and normal pituitary〔J〕.Pituitary，2015；18(1)：31-41.

8 Christian PM，Stephan P，Michael B，etal.Histological criteria for atypical pituitary adenomas - data from the German pituitary adenoma registry suggests modifications〔J〕.Acta Neuropathol Commun，2015；3(8)：50.

9 Lines KE，Stevenson M，Thakker RV.Animal models of pituitary neoplasia〔J〕.Mol Cell Endocrinol，2016；421(2)：68-81.

10 Antoine V，Motet C，Schmitt E，etal.MRI imaging of the neural pituitary〔J〕.Ann Endocfinol(Pails)，2008；4(3)：181-92.

11 Komotar RJ，Starke RM，Raper DM，etal.Endoscopic endonasal compared with microscopic transsphenoidal and open transcranial resection of giant pituitary adenomas〔J〕.Pituitary，2012：15(2):150-9.

12 Maeda M, Murakami Y, Watari K,etal.CpG hypermethylation contributes to decreased expression of PTEN during acquired resistance to gefitinib in human lung cancer cell lines〔J〕.Lung Cancer,2015;87(3):265-71.

13 Trinh NT, Yamashita T, Ohneda K. Increased expression of EGR-1 in diabetic human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells reduces their wound healing capacity〔J〕.Stem Cells Dev,2016;25(10):760-73.

14 Maria L,Clorinda A，Luigi B，etal.TP53 and PIK3CA gene mutations in adenocarcinoma，squamous cell carcinoma and high-grade intraepithelial neoplasia of the cervix〔J〕.J Transl Med，2014；12：255.

15 Durmus B，Kenan G，Duygu S，etal.Tbx3 represses PTEN and is over-expressed in head and neck squamous cell carcinoma〔J〕.BMC Cancer，2012；12(10)：481.

16 Evin O，Aysim G，Esra E，etal.Heparin inhibits hepatocyte growth factor induced motility and invasion of hepatocellular carcinoma cells through early growth response protein〔J〕.PLoS One，2012；7(8)：e42717.

17 He J，Yu J J，Xu Q，etal.Downregulation of ATG14 by EGR1-MIR152 sensitizes ovarian cancer cells to cisplatin-induced apoptosis by inhibiting cyto-protective autophagy〔J〕.Autophagy，2015；11(2)：373-84.

〔2014-12-19修回〕

(編輯 苑云杰)

鄭州市2014年度“常州四藥臨床藥學科研基金”科研項目(No.CZSYJJ14031)

1 鄭州大學第二附屬醫院心血管內科

黨 帥(1972-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事顱腦損傷和腦血管疾病臨床研究。

R730.4

A

1005-9202(2016)23-5832-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.026