育齡女性MTHFR基因多態性與HCY關系的研究

楊豐美，于艷，張麗萍

(1.湖北醫藥學院附屬太和醫院婦產科, 湖北 十堰 442000; 2.泰州市姜堰區太宇醫院檢驗科，江蘇 泰州 225500)

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育齡女性MTHFR基因多態性與HCY關系的研究

楊豐美1，于艷2，張麗萍1

(1.湖北醫藥學院附屬太和醫院婦產科, 湖北 十堰 442000; 2.泰州市姜堰區太宇醫院檢驗科，江蘇 泰州 225500)

目的：通過對育齡女性葉酸代謝關鍵酶5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFRC677T的基因多態性檢測，分析MTHFRC677T基因多態性與外周血中同型半胱氨酸HCY的關系。方法：選取孕前或孕期育齡女性100名，基因芯片法檢測外周血中MTHFRC677T的基因多態性，并對所有育齡女性口服800μg葉酸1個月，循環酶法檢測口服葉酸前后不同基因型女性外周血中HCY水平。結果：本地區育齡婦女中MTHFRC677T基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為26%、54%、20%；口服葉酸前CC型、CT型、TT型受試者HCY水平分別為9.5±3.4、11.8±3.1、15.3±3.5，口服葉酸后CC型、CT型、TT型受試者HCY濃度較口服前低，分別為8.1±2.8、8.4±2.7、11.0±3.3，CC型受試者口服葉酸前后平均HCY水平之間差異無統計學意義(P>0.05)，CT型和TT型受試者口服葉酸前后平均HCY水平之間差異有統計學意義(P<0.05)。結論：口服葉酸可以改善由于MTHFRC677T基因突變引起的高HCY血癥，合理補充葉酸可以避免由于高HCY血癥引起的出生缺陷。

亞甲基四氫葉酸還原酶；同型半胱氨酸；葉酸；多態性

出生缺陷在我國比較常見，總發生率大約5.6%[1]，出生缺陷的圍生兒給社會和家庭帶來了嚴重的負擔。育齡女性體內的葉酸不能被機體有效利用或者攝入不足均可以導致嬰幼兒出生缺陷的發生。葉酸的吸收或代謝障礙可以導致多種出生缺陷性疾病的發生，比如神經管畸形、先天性心臟病以及唇腭裂等[2-6]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝過程中的關鍵酶，在HCY向蛋氨酸轉化以及DNA合成過程中發揮著重要作用。雖然育齡女性口服葉酸在預防神經管畸形有著一定的作用，但是流行病學研究表明圍孕期增補葉酸存在有地域性、人群性的差異[7-8]。本文采用基因芯片法檢測MTHFR C677T等位基因的突變，分析基因突變與口服葉酸前后HCY濃度變化之間的關系，進而為降低高HCY血癥引起的出生缺陷提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集我院2014年5月至2015年4月門診接待的育齡女性100名，告知基因檢測的目的和意義，根據知情同意后進行抽血及口服葉酸治療。抽取外周EDTA-K2抗凝血3 mL用于全基因組DNA的提取。育齡女性平均年齡為(26.5±4.9)歲。

1.2 主要試劑與儀器

全血DNA提取試劑盒(北京天根)；ND-2000微量核酸定量儀(Thermo公司)；PE7500擴增儀(ABI)；AU2700全自動生化儀(貝克曼)；基因芯片儀，芯片識讀儀(上海百傲)； HCY濃度檢測試劑盒(北京九強)。

1.3 方法

1.3.1 口服葉酸 根據基因檢測結果分為CC組、CT組和TT組。所有育齡女性給予800 μg劑量葉酸口服1個月。抽取口服葉酸前及口服葉酸1個月以后空腹外周EDTA-K2抗凝血5 mL用于檢測葉酸以及HCY濃度。

1.3.2 HCY濃度檢測 HCY在全自動生化分析儀上進行檢測，所有試劑均采用配套試劑盒，定標后測試，正常參考區間按照說明書進行設置。

1.3.3 外周血中DNA提取 EDTA抗凝血采集后需按照試劑盒操作說明提取外周血中的全基因組DNA，若不能及時提取應4 ℃保存，一般不宜存放超過1周。提取后的DNA經微量核酸定量儀測定其濃度和純度后進行PCR擴增或者-80 ℃保存備用。

1.3.4 PCR擴增 提取后的DNA經過PCR擴增獲取PCR產物。擴增條件為：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35個循環；72 ℃ 5 min。獲取的擴增產物需進行雜交反應或-20 ℃保存備用。

1.3.5 雜交及芯片識讀 對上述PCR產物進行雜交，雜交體系及雜交條件參照說明書進行。雜交結束后將芯片放置于芯片識讀儀中對結果進行掃描判定。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 所有育齡女性MTHFR C677T基因多態性分析

100名育齡女性中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為26%、54%、20%，等位基因頻率為C53%、T47%。育齡女性不同基因型(CC型、CT型、TT型)的判讀結果如圖1所示。

2.2 不同基因型育齡女性口服葉酸前后HCY濃度的變化

統計學分析發現，CC型受試者口服葉酸前后平均HCY水平之間差異無統計學意義(P>0.05)，CT型和TT型受試者口服葉酸前后平均HCY水平之間差異有統計學意義(P<0.05)。不同基因型育齡女性口服葉酸前后HCY濃度的變化如表1所示。

表1 不同基因型育齡婦女口服葉酸前后HCY濃度的變化

CC型口服前口服后CT型口服前口服后TT型口服前口服后HCY(μmol/L)9．5±3．48．1±2．811．8±3．18．4±2．715．3±3．511．0±3．3t值1．66．24．6P值>0．05<0．001<0．001

3 討論

嬰幼兒的出生缺陷是世界性關注的問題，特別是在發展中國家。葉酸的攝入和代謝障礙是導致出生缺陷的重要原因之一。葉酸是一種水溶性的B族維生素，吸收的葉酸以N5-甲基四氫葉酸的形式存在血液中，和白蛋白疏松結合運輸，通過葉酸受體被攝入細胞內，在維生素B12依賴的蛋氨酸合成酶作用下形成四氫葉酸而發揮作用。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝過程中的關鍵酶，在葉酸代謝過程中起到重要作用。研究表明MTHFR 677位點的基因多態性可以影響到該酶的活性，葉酸濃度降低，蛋氨酸合成減少，進而使得HCY淤積過多，產生高HCY血癥，導致神經管畸形的發生[9-12]。本文采用基因芯片法檢測MTHFR C677T等位基因的突變，分析基因突變與口服葉酸前后HCY濃度變化之間的關系，進而為降低高HCY血癥引起的出生缺陷提供一定的理論依據。

微陣列技術就是利用分子雜交原理，使同時被比較的標本(用同位素或熒光素標記)與微陣列雜交，并包被于芯片上，通過檢測包被芯片雜交信號強度及數據處理，用一種直觀圖像反映出基因多態性的分型，常常用于遺傳性基因多態性的分析。本文采用DNA微陣列芯片法檢測育齡女性外周血中MTHFR基因多態性發現，MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為26%、54%、20%，可以很好的檢出MTHFR C677T基因多態性分型。研究表明CT型、TT型的基因突變可以降低MTHFR的酶活性，導致葉酸代謝途徑障礙[13-14]。這就使得突變型的育齡女性在攝入正常劑量的葉酸時，由于MTHFR酶活性的降低導致高HCY血癥，進而增加神經管缺陷的風險。而如果通過基因檢測，使得突變型的育齡女性攝入大劑量的葉酸，提高酶活性，同樣可以維持正常的HCY代謝濃度，降低由于高HCY血癥導致的出生缺陷風險。本文中研究發現，CC型受試者口服葉酸前后平均HCY濃度變化無統計學意義，而突變型CT、TT受試者口服葉酸前后平均HCY濃度變化比較明顯，口服后的濃度要低于口服前，這與國內研究結果一致[15]，表明口服大劑量的葉酸對于MTHFR C677T基因突變型的育齡女性降低體內的HCY濃度，減少HCY淤積起著非常重要的作用。

綜上所述，通過檢測本地區育齡女性MTHFR C677T基因多態性，因地制宜的制定個體化的葉酸增補方案，對于降低高HCY血癥，減少嬰幼兒出生缺陷率有一定的預防指導意義。

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(學術編輯：楊健)

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Study on the relationship between the MTHFR gene polymorphism of fertile women and the level of HCY

YANG Feng-mei1,YU Yan2,ZHANG Li-ping1

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,Hubei;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,JiangyanDistrictTaiyuHospital,Taizhou225500,Jiangsu，China)

Objective：To detect the MTHFR gene polymorphism,the HCY levels and analyze the correlation of MTHFR C677T gene polymorphism and the HCY levels in childbearing age women.Methods：Gene chip method was used to examine the polymorphism,and given dose of folacin 800 μg for a month, and the level of HCY was analyzed by cyclophorase assay in 100 women of childbearing age.Results：Detection rate of gene polymorphism were 26%,54%,20% in CC,CT,TT;before oral folic acid,the HCY levels were 9.5±3.4,11.8±3.1,15.3±3.5 in CC,CT,TT,after oral folic acid,the HCY levels were 8.1±2.8,8.4±2.7,11.0±3.3 in CC,CT,TT.CC genotype groups resulted in no significant difference (P>0.05),and CT,TT genotype groups resulted in significant differences (P<0.05).Conclusion：Oral folic acid can reduce the HCY levels caused by the MTHFR gene C677T mutation;a reasonable folic acid supplementation can prevent birth defects caused by high HCY levels.

MTHFR;HCY;Folic acid;Gene polymorphism

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.02.16

太和醫院院級項目(2014JJXM019)

2015-06-09

楊豐美(1982-)，女，主治醫師。 通訊作者：張麗萍，E-mail：29256175@qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160425.1131.032.html

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