馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺抗性突變體的獲得及其生物學(xué)性狀

羅彥濤，孟潤杰，趙建江，韓秀英，馬志強(qiáng)，王文橋，張小風(fēng)

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馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺抗性突變體的獲得及其生物學(xué)性狀

羅彥濤1,2，孟潤杰1，趙建江1，韓秀英1，馬志強(qiáng)1，王文橋1，張小風(fēng)1

（1河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河北保定 071000；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071000）

【目的】研究抗氟吡菌胺突變體對不同殺菌劑的交互抗性并評估馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)。【方法】通過紫外線照射菌絲體、紫外線照射孢子囊和藥劑馴化的方法獲得抗氟吡菌胺的馬鈴薯晚疫病菌突變體，計(jì)算突變體的突變頻率，測定抗性突變體的抗性水平，研究突變體在無藥條件下繼代培養(yǎng)10代后抗性能否穩(wěn)定遺傳，測定突變體在RSA培養(yǎng)基和離體葉片上的適合度（菌絲生長速率、產(chǎn)孢子囊能力及復(fù)合適合度指數(shù)），比較抗性菌株與其親本敏感菌株的競爭力，分析對氟吡菌胺表現(xiàn)不同敏感性的菌株對不同藥劑的交互抗性，并通過筆者實(shí)驗(yàn)室建立的抗性風(fēng)險(xiǎn)量化標(biāo)準(zhǔn)評定馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)。【結(jié)果】共獲得21個抗性菌株，抗性水平介于61—3 157倍，紫外線誘導(dǎo)孢子囊的突變率為2.78×10-7；大多數(shù)抗性突變體的適合度與其親本菌株無顯著性差異；競爭力測定試驗(yàn)中，2株突變體的第1、3、7代的共18次抗藥頻率測定中，有3次測定的抗藥頻率顯著低于初始頻率，有4次測定的抗藥頻率顯著高于初始頻率，其余11次測定的抗藥頻率與初始頻率均無顯著性差異；所有突變菌株的抗藥性均能穩(wěn)定遺傳；抗氟吡菌胺菌株及其親本菌株對氟吡菌胺的lgEC50與這些菌株對嘧菌酯、吡唑醚菌酯、霜脲氰、烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、甲霜靈、氟醚菌酰胺的lgEC50之間的相關(guān)系數(shù)()分別為0.104(=0.654)、0.311(=0.170)、0.228(=0.081)、0.376(=0.093)、0.214(=0.351)、0.122(=0.599)、0.963(=0.000)；致病疫霉對氟吡菌胺基本抗性風(fēng)險(xiǎn)值為15。【結(jié)論】氟吡菌胺與氟醚菌酰胺之間存在交互抗性，與嘧菌酯、吡唑醚菌酯、霜脲氰、烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、甲霜靈之間無交互抗性，馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的固有抗性風(fēng)險(xiǎn)為高度,應(yīng)加強(qiáng)馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)管理，建議生產(chǎn)上將氟吡菌胺與其他類藥劑交替或混合使用。

馬鈴薯晚疫病菌；氟吡菌胺；抗性突變體；生物學(xué)性狀；交互抗性；基本風(fēng)險(xiǎn)

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是世界上第四大糧食作物，在保障糧食安全、促進(jìn)農(nóng)民增收、消除貧困方面具有重要的戰(zhàn)略意義。中國逐步推進(jìn)的馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略推動了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。由致病疫霉（）引起的馬鈴薯晚疫病是一種毀滅性的病害，每年在全世界范圍內(nèi)造成的經(jīng)濟(jì)損失約為67億美元[3-4]，曾造成歷史上著名的愛爾蘭大饑荒[5]，是阻礙中國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。化學(xué)防治是目前的馬鈴薯生產(chǎn)上控制馬鈴薯晚疫病的重要手段。氟吡菌胺在馬鈴薯晚疫病防治中廣泛應(yīng)用,且效果良好[6-7]。通過評估馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而指導(dǎo)氟吡菌胺在馬鈴薯晚疫病防治中的合理使用，對減緩抗性產(chǎn)生，延長農(nóng)藥生命周期具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】氟吡菌胺是拜耳公司研發(fā)的新型藥劑，對卵菌綱特效，對病菌的各生長期均有抑制作用，其作用機(jī)理為通過作用于一種特異性蛋白——類血影蛋白，影響細(xì)胞的有絲分裂，破壞病原菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)殺菌活性[8-10]。馬鈴薯晚疫病菌經(jīng)風(fēng)雨傳播，再侵染頻繁，被殺菌劑抗性行動委員會（FRAC）劃定為高抗藥性風(fēng)險(xiǎn)病原菌，已對甲霜靈產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性，因此需重視馬鈴薯晚疫病的抗藥性研究和治理工作[11-13]。FRAC尚未確定氟吡菌胺抗性風(fēng)險(xiǎn)的高低[14-15]。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)黃瓜霜霉病菌（）對氟吡菌胺存在中到高度抗性風(fēng)險(xiǎn)，Lu等[17-18]發(fā)現(xiàn)辣椒疫霉（）對氟吡菌胺存在中到高度抗性風(fēng)險(xiǎn)。黃瓜霜霉病菌、辣椒疫霉和馬鈴薯晚疫病菌都有不同交配型[19-22]，有性生殖為病原菌提供了遺傳變異的重要來源。由于寄主作物的種植模式、用藥習(xí)慣、生長條件等各不相同，且病原菌具有不同遺傳特性，因此，研究馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。Gisi等[23]將殺菌劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)分為基本風(fēng)險(xiǎn)和治理風(fēng)險(xiǎn)，并分別賦予相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)值，靶標(biāo)菌對殺菌劑的全部抗性風(fēng)險(xiǎn)值為基本風(fēng)險(xiǎn)值與治理風(fēng)險(xiǎn)值之積。該評分標(biāo)準(zhǔn)過于復(fù)雜，實(shí)用性較差。Brent等[24]簡化了Gisi的方法，認(rèn)為植物病原菌對殺菌劑的基本抗性風(fēng)險(xiǎn)由藥劑和病害決定，并提出由藥劑和病害決定的抗性風(fēng)險(xiǎn)特征，并根據(jù)藥劑基本風(fēng)險(xiǎn)和病害決定的基本風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重程度賦予相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)值，病害對殺菌劑的基本風(fēng)險(xiǎn)值為病害基本風(fēng)險(xiǎn)值與藥劑基本風(fēng)險(xiǎn)值之積。該方法將殺菌劑和病原菌進(jìn)行分類概括，不便于評估特定病原菌對特定藥劑的風(fēng)險(xiǎn)。【本研究切入點(diǎn)】目前尚無馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺抗性風(fēng)險(xiǎn)評估的報(bào)道，很少有氟吡菌胺與其他藥劑存在交互抗性的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得抗氟吡菌胺突變體，研究所獲抗性突變體的生物學(xué)性狀以及氟吡菌胺與其他殺菌劑的交互抗性，并量化評估馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)，為氟吡菌胺的合理使用和制定其抗藥性治理策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014年6月至2015年12月在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所殺菌劑組完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試親本菌株（野生敏感菌株） 馬鈴薯晚疫病菌從田間采集并分離（表1）。

表1 供試親本菌株的采集時間及地點(diǎn)

1.1.2 供試藥劑 95%氟吡菌胺原藥，拜耳作物科學(xué)公司；95%嘧菌酯原藥，南京金土地化工有限公司；98%氟醚菌酰胺原藥，山東聯(lián)合農(nóng)化有限公司；98%吡唑醚菌酯原藥，巴斯夫歐洲公司；98%霜脲氰原藥，杜邦公司；95%雙炔酰菌胺原藥，先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；97%甲霜靈原藥，沈陽化工研究院；97.6%烯酰嗎啉原藥，河北冠龍農(nóng)化有限公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（rye sucrose agar，RSA）：黑麥80 g，瓊脂10 g，蔗糖20 g，蒸餾水定容至1 L。

1.1.4 供試儀器 恒溫生化培養(yǎng)箱，超凈工作臺，電熱恒溫水浴鍋，移液槍等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗氟吡菌胺突變菌株的獲得 UV誘導(dǎo)菌絲體：黑暗條件下將預(yù)培養(yǎng)好的敏感菌株置于紫外燈（15 W，254 nm，預(yù)熱30 min）下方垂直距離25 cm處照射亞致死時間（30 min），紅光條件下從菌落邊緣切取10 mm×10 mm×3 mm的菌塊，移入含最低抑制濃度（MIC，15 mg·L-1）氟吡菌胺的RSA平板上，每個菌株轉(zhuǎn)接10皿，每皿4塊，18℃黑暗培養(yǎng)7—10 d，若能在含MIC及以上濃度氟吡菌胺的RSA平板上生長，表明該野生敏感菌株對供試藥劑產(chǎn)生了抗藥性，按公式（1）計(jì)算抗性突變頻率[25]。

抗性突變頻率（%）=（出現(xiàn)突變的菌餅數(shù)/供試的菌餅總數(shù)）×100 （1）

UV誘導(dǎo)孢子囊：將野生敏感菌株在RSA平板上培養(yǎng)7 d后產(chǎn)生大量孢子囊，用無菌水洗下，用雙層紗布過濾，在顯微鏡下調(diào)至5×105個/mL的孢子囊懸浮液。在無菌操作條件下，取上述孢子囊懸浮液5 mL置于距紫外燈（15 W，254 nm，預(yù)熱30 min）下方垂直距離25 cm處，振蕩條件下照射亞致死時間（3 min），紅光條件下將照射后的孢子囊懸浮液涂布在含MIC氟吡菌胺的直徑9 cm的RSA平板上，每菌株接種20皿，每皿0.1 mL，黑暗18℃培養(yǎng)7—10 d，若能在含MIC及以上濃度氟吡菌胺的RSA平板上生長，表明該野生敏感菌株對供試藥劑產(chǎn)生了抗藥性，按公式（2）計(jì)算突變頻率[26]。

抗性突變頻率=抗性突變菌株數(shù)/受紫外線照射的孢子囊數(shù) （2）

藥劑馴化：將敏感菌株接種到含系列濃度氟吡菌胺的RSA平板上，培養(yǎng)觀察菌絲生長情況，確定氟吡菌胺對馬鈴薯晚疫病菌的“亞致死濃度”為10 mg·L-1。在含10 mg·L-1氟吡菌胺的RSA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)對氟吡菌胺敏感的菌株，每隔10 d將菌絲生長相對較快的菌株轉(zhuǎn)移至含度氟吡菌胺的平板上，逐漸加大氟吡菌胺的濃度，直至其能在含有大于或等于最低抑制濃度氟吡菌胺的RSA培養(yǎng)基上生長。

1.2.2 抗氟吡菌胺突變體的抗性水平測定 采用菌絲生長速率法[27]分別測定抗藥性突變體和親本菌株的EC50。用丙酮溶解氟吡菌胺原藥，分別配制為500、250、125、62.5、31.25 mg·L-1和100、50、10、5、1 mg·L-1的系列濃度，分別用于測定不同抗性水平的突變體，各處理及對照含等濃度的丙酮；測定親本敏感菌株EC50的系列濃度為10、5、1、0.5、0.1 mg·L-1，設(shè)空白對照。將培養(yǎng)好的菌株用打孔器沿菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌塊，分別移到含系列濃度氟吡菌胺的培養(yǎng)基平板中央，每處理濃度接種3皿，18℃左右黑暗培養(yǎng)8 d，當(dāng)對照（即不含殺菌劑的培養(yǎng)基平板）的菌落直徑至少達(dá)3 cm時，用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑制率，求出各菌株的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50，然后求出各抗藥突變體的抗性倍數(shù)（resistance ratio，RR），即RR=EC50（抗藥突變體）/ EC50（親本敏感菌株）。

1.2.3 抗氟吡菌胺突變體的穩(wěn)定性測定 將得到的抗性突變體在無藥RSA平板上通過菌絲體連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，然后測定第10代的EC50，根據(jù)敏感性變化指數(shù)（第10代EC50與第1代EC50的比值）來判斷其抗藥穩(wěn)定性。

1.2.4 抗氟吡菌胺突變體適合度的測定 參照朱志峰[28]的方法，測定各抗藥突變體及其親本菌株在RSA平板上的菌絲生長速率，并用血球計(jì)數(shù)板測定各抗藥突變體及其親本菌株的產(chǎn)孢子囊總數(shù)。

參照侯淑英等[29]的方法，將供試抗性突變體及其親本菌株接種在RSA培養(yǎng)基上，18℃黑暗培養(yǎng)15 d，用無菌水洗下孢子囊制成1×105個/mL孢子囊懸浮液，4℃誘發(fā)游動孢子釋放，制成游動孢子懸浮液，備用。采摘馬鈴薯植株中部長勢一致、大小適中的葉片，擺放在鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿（φ=15 cm）中，每皿中放置一片復(fù)葉（5個小葉），每個處理重復(fù)3次。在葉背主葉脈旁接種10 μL游動孢子懸浮液，18℃（16 h光照，8 h黑暗）保濕培養(yǎng)4 d，檢查葉片發(fā)病情況、病斑大小、產(chǎn)孢量，計(jì)算侵染率、病斑面積、產(chǎn)孢能力和復(fù)合適合度指數(shù)。

1.2.5 抗氟吡菌胺突變體的競爭力測定 參照Kadish等[30-31]的方法，將抗性菌株與敏感菌株的孢子囊以不同比例（4﹕1、1﹕1、1﹕4）混合成孢子囊懸浮液（5×104個/mL），在未用藥的葉片上繼代培養(yǎng)。采用液滴法將1、3、7代的孢子囊懸浮液分別接種于未經(jīng)藥劑處理和經(jīng)親本敏感菌株MIC濃度氟吡菌胺處理的葉片背面，每個處理10個葉片，重復(fù)3次，18℃（16 h光照，8 h黑暗）保濕培養(yǎng)4—6 d，檢查葉片發(fā)病情況，按（3）式估算1、3、7代的抗性菌株頻率[32]。

抗藥性突變體的頻率（%）=（藥劑處理葉片上的發(fā)病面積/未用藥劑處理葉片的發(fā)病面積）×100 （3）

1.2.6 抗氟吡菌胺突變體對不同藥劑的交互抗性測定 選取15個突變菌株及其6個親本敏感菌株，采用菌絲生長速率法分別測定這些菌株對霜脲氰、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、甲霜靈及氟醚菌酰胺的敏感性，分析抗性突變體對7種藥劑的交互抗性情況。使用SPSS軟件分析對氟吡菌胺敏感和抗性的各供試菌株EC50的對數(shù)值與供試各菌株對嘧菌酯、吡唑醚菌酯、霜脲氰、烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、甲霜靈、氟醚菌酰胺EC50的對數(shù)值之間的相關(guān)性，如果＞0.05，即在=0.05的水平下差異不顯著，則兩種藥劑之間無相關(guān)性，不存在交互抗性關(guān)系；如果＜0.05，表明兩種藥劑有相關(guān)性，此時相關(guān)系數(shù)（）越高，相關(guān)性越大，通常認(rèn)為＞0.75時，兩種藥劑之間存在交互抗性關(guān)系。

1.2.7 馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺抗性風(fēng)險(xiǎn)的量化評估 本實(shí)驗(yàn)室在前人的研究基礎(chǔ)上，建立了新的抗性風(fēng)險(xiǎn)量化評估體系，將基本風(fēng)險(xiǎn)分為7個風(fēng)險(xiǎn)因素，分別賦予0、1、2、3個風(fēng)險(xiǎn)值，各風(fēng)險(xiǎn)值之和即為病原菌對藥劑的基本風(fēng)險(xiǎn)值。基本風(fēng)險(xiǎn)值為0—7為低度風(fēng)險(xiǎn)，8—14為中度風(fēng)險(xiǎn)，15—21為高度風(fēng)險(xiǎn)。具體標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 植物病原菌對殺菌劑的基本抗性風(fēng)險(xiǎn)量化評估標(biāo)準(zhǔn)

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.05、SPSS 21.0及Microsoft Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 抗氟吡菌胺突變體的獲得

通過紫外線誘導(dǎo)菌絲體共獲得13個抗氟吡菌胺突變體，突變頻率為1.8%；通過紫外線誘導(dǎo)孢子囊共獲得5個抗氟吡菌胺突變體，突變頻率為2.78×10-7；通過藥劑馴化共獲得3個抗氟吡菌胺突變體，藥劑馴化的抗性水平變化見圖1。

圖1 馬鈴薯晚疫病菌經(jīng)藥劑馴化18代對氟吡菌胺抗性水平變化

2.2 抗氟吡菌胺突變體的抗性水平

獲得的21個抗氟吡菌胺突變體的抗性水平較高，介于61—3 157倍（表3）。

表3 馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺抗性突變體的抗性水平

*：親本敏感菌株parental isolates；UVM：紫外線誘導(dǎo)菌絲塊所得突變菌株resistant mutants acquired by UV irradiating sporangia；UVS：紫外線誘導(dǎo)孢子囊所得突變菌株Mutants acquired by UV irradiating mycelium；FT：藥劑馴化所得突變菌株Resistant mutants acquired by fungicide taming。下同The same as below

2.3 抗氟吡菌胺突變體的抗性穩(wěn)定性

所得抗氟吡菌胺的突變體在不含藥的RSA平板上繼代培養(yǎng)10代后，測定其對氟吡菌胺的敏感性。結(jié)果表明，抗性突變體DD10UVM2、DD10FT、DD18UVM1、DD18UVM2、ZC10UVM1、ZC10UVM2、NL12UVM1、NL12UVS、NL12UVS2、DG21UVM1、DG21UVM2、DG21UVS繼代培養(yǎng)10代后對氟吡菌胺敏感性無明顯變化，表明其對氟吡菌胺的抗藥性可以穩(wěn)定遺傳；抗性突變體DD8UVM1、DD10UVM1、DD10UVS、DD18UVM3、DD18UVS、NL12FT、NL12UVM2、NL12UVM3、ZC10FT繼代培養(yǎng)10代后對氟吡菌胺敏感性上升明顯，但抗性水平依然很高（表4）。

表4 馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺抗性突變體的抗性穩(wěn)定性

FSC是第10代EC50與第1代EC50的比值 FSC=factor of sensitivity change for fluopicolide mutants, a ratio of EC50values of the10th /1st transferred culture

2.4 抗氟吡菌胺抗性突變體的適合度

抗性菌株DG21UVM和DG21UVS的菌絲生長速率顯著大于其親本菌株DG21，親本菌株DD10、DD18、ZC10和NL12的菌絲生長速率分別顯著大于其抗性突變體DD10FT、DD18UVS、ZC10UVM、ZC10FT、NL12UVS2和NL12FT，其余抗性菌株菌絲生長速率與親本菌株無顯著差異；親本菌株DD10、ZC10和NL12的產(chǎn)孢子囊能力分別顯著大于其抗性菌株DD10FT、ZC10FT、NL12UVS2、NL12FT，抗性菌株DD18UVM和DD18UVS的產(chǎn)孢子囊能力顯著大于親本菌株DD18，其余抗性菌株的產(chǎn)孢子囊能力與其親本菌株無顯著差異（表5）。

表5 抗氟吡菌胺突變體及親本菌株的菌絲生長速率及產(chǎn)孢子囊能力

根據(jù)DMRT分析，表中同列數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示在=0.05的水平下差異不顯著。下同F(xiàn)igures in the same column followed by the same lowercases were not significantly different using DMRT (=0.05). The same as below

馬鈴薯晚疫病菌的親本敏感菌株和抗氟吡菌胺突變體在馬鈴薯葉片上的侵染率均為100%；親本菌株ZC10、NL12、DD10和DG21的病斑面積分別顯著大于其抗性菌株 ZC10FT、NL12UVM、NL12UVS2、NL12FT、DD10FT和DG21UVM，抗性菌株DD18UVM和DD10UVM分別顯著大于其親本菌株DD18和DD10，其余抗性菌株的病斑面積與其親本菌株無顯著性差異；親本菌株ZC10、DD18、NL12、DD10和DG21的產(chǎn)孢子囊能力分別顯著強(qiáng)于其抗性菌株 ZC10FT、DD18UVM、NL12FT、DD10UVM、DD10UVS、DD10FT、DG21UVS，抗性菌株DG21UVM的產(chǎn)孢子囊能力顯著強(qiáng)于其親本菌株DG21，其余抗性菌株的產(chǎn)孢子囊能力與親本菌株無顯著性差異；親本菌株ZC10、DD18、NL12、DD10、DG21的復(fù)合適合度指數(shù)顯著高于ZC10FT、 DD18UVS、NL12UVM、NL12FT、NL12UVS2、DD10UVS、DD10FT、DG21UVS，其余抗性菌株的復(fù)合適合度指數(shù)與其親本菌株無顯著性差異（表6）。

表6 抗氟吡菌胺抗性突變菌株及親本菌株的復(fù)合適合度指數(shù)

2.5 抗氟吡菌胺突變體的競爭力

抗性菌株ZC10UVM1和 NL12UVS1分別與其親本敏感菌株以不同比例混合接種，在第1、3、7代的共18次抗藥頻率測定中，有3次測定的抗藥頻率顯著低于初始頻率，有4次測定的抗藥頻率顯著高于初始頻率，其余11次測定的抗藥頻率與初始頻率均無顯著性差異（表7）。

表7 抗性突變菌株及其親本菌株競爭力的比較

同行數(shù)據(jù)后不同字母表示同一菌株各代敏感性之間存在顯著差異（＜0.05）

The different letters in the same row indicated significant differences in different progenies of the same isolate (＜0.05)

2.6 氟吡菌胺與其他藥劑的交互抗藥性

通過SPSS軟件計(jì)算不同馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性突變體及其親本菌株的lgEC50與這些菌株對嘧菌酯、吡唑醚菌酯、霜脲氰、烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、甲霜靈、氟醚菌酰胺的lgEC50之間的相關(guān)系數(shù)（）分別為0.104（=0.654）、0.311（=0.170）、0.228（=0.081）、0.376（=0.093）、0.214（=0.351）、0.122（=0.599）、0.963（=0.000），表明氟吡菌胺與嘧菌酯、吡唑醚菌酯、霜脲氰、烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、甲霜靈無交互抗性關(guān)系，與氟醚菌酰胺之間存在交互抗性關(guān)系（圖2）。

坐標(biāo)值均為lgEC50值 Coordinate values were lgEC50 values

2.7 馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)量化評估

根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室建立的標(biāo)準(zhǔn)，馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)值量化如下：（1）田間能檢測到低抗菌株，田間抗性菌株出現(xiàn)引起的風(fēng)險(xiǎn)值為1；（2）氟吡菌胺與氟醚菌酰胺存在正交互抗性，交互抗性引起的風(fēng)險(xiǎn)值為1；（3）實(shí)驗(yàn)室條件下通過紫外線誘導(dǎo)和藥劑馴化均獲得抗氟吡菌胺突變體，紫外線誘導(dǎo)孢子囊的突變頻率為2.78×10-7，實(shí)驗(yàn)室抗性突變引起的風(fēng)險(xiǎn)值為3；（4）實(shí)驗(yàn)室獲得的抗性突變體抗性水平介于61—3 157倍，以高抗菌株為主，抗藥性符合單基因突變特征，引起的抗性風(fēng)險(xiǎn)值為3；（5）大部分抗性突變體適合度不下降，少數(shù)抗性菌株適合度下降，抗性菌株適合度引起的風(fēng)險(xiǎn)值為2；（6）大多數(shù)抗性突變體競爭力強(qiáng)，少數(shù)競爭力較弱，抗性菌株競爭力引起的風(fēng)險(xiǎn)值為2；（7）所有抗性菌株在無藥條件下繼代培養(yǎng)后，其抗藥性均能穩(wěn)定遺傳，抗性菌株遺傳穩(wěn)定性引起的風(fēng)險(xiǎn)值為3。上述7個方面的風(fēng)險(xiǎn)值累加得到致病疫霉對氟吡菌胺的全部基本抗性風(fēng)險(xiǎn)值為15，因此，馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的基本抗性風(fēng)險(xiǎn)為高度。

3 討論

按照本文中的抗性風(fēng)險(xiǎn)量化評估標(biāo)準(zhǔn)，氟吡菌胺的全部基本抗性風(fēng)險(xiǎn)值為15，是高度風(fēng)險(xiǎn)的最下限。室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估是抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的重要組成部分，但不能完全取代田間抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，本標(biāo)準(zhǔn)更側(cè)重于實(shí)驗(yàn)室條件下的抗性風(fēng)險(xiǎn)，即固有風(fēng)險(xiǎn)，藥劑的使用方式、年限、次數(shù)等因素對田間抗性的發(fā)生發(fā)展有重要的作用，因此應(yīng)加強(qiáng)田間抗藥性的發(fā)展動態(tài)，筆者實(shí)驗(yàn)室連續(xù)多年監(jiān)測了多個地區(qū)田間馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的敏感性（結(jié)果待發(fā)表）。由于氟吡菌胺的制劑為混劑，且當(dāng)前有多種化學(xué)藥劑用于防治馬鈴薯晚疫病，減緩了田間抗性的發(fā)生和發(fā)展趨勢，因此，雖然田間尚未發(fā)現(xiàn)中高抗菌株，但是必須高度重視馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)管理工作。

適合度是抗性菌株和親本敏感菌株單獨(dú)存在時生存或致病能力的反映，競爭力反映了抗性菌株與敏感菌株共存時彼此的消長或競爭情況。本試驗(yàn)中多數(shù)突變體的菌絲生長速率、產(chǎn)孢子囊能力、復(fù)合適合度指數(shù)和競爭力與其親本菌株無顯著差異，部分突變體的適合度和競爭力強(qiáng)于或弱于其親本菌株，因此，抗性菌株有在田間發(fā)展成優(yōu)勢種群的可能，需加強(qiáng)抗性的監(jiān)測和治理。

當(dāng)前的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估中主要通過紫外線誘導(dǎo)和藥劑馴化來獲得抗性突變體。本文通過紫外線誘導(dǎo)菌絲體、紫外線誘導(dǎo)孢子囊和藥劑馴化分別獲得13、5和3個抗性突變體。3種方法各有利弊：紫外線誘導(dǎo)菌絲體試驗(yàn)中，由于菌餅中含有的菌絲及孢子囊數(shù)量很大，菌絲有一定的厚度且表面參差不齊，因此不同部位的菌絲和孢子囊受接收到紫外線照射的能量也各不相同，產(chǎn)生突變體的可能性就相對較大，缺點(diǎn)在于所得出的突變頻率誤差較大，不能量化的評價(jià)病菌產(chǎn)生抗性的難易程度；紫外誘導(dǎo)孢子囊試驗(yàn)中，需要較準(zhǔn)確的找出紫外線照射孢子囊的亞致死時間，且由于孢子囊懸浮液的濃度相對較小，需要很大的工作量才能得到足夠數(shù)量的突變體，優(yōu)點(diǎn)在于能夠準(zhǔn)確得出突變頻率，能夠量化的評價(jià)病菌產(chǎn)生抗性的難易程度；藥劑馴化試驗(yàn)中，需要找出藥劑對病菌的亞致死濃度且濃度需要逐步提高，且需連續(xù)馴化多代，所需時間較長，而且無法準(zhǔn)確得出突變頻率，優(yōu)點(diǎn)在于與實(shí)際田間用藥情況更相似，更接近于田間抗藥性的發(fā)生情況。

氟醚菌酰胺是山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司與山東農(nóng)業(yè)大學(xué)合作，于2010年創(chuàng)制的一種新型含氟苯甲酰胺類殺菌劑，2015年獲藥檢所臨時登記。與氟吡菌胺相比，氟醚菌酰胺在結(jié)構(gòu)上減少了2個氯原子，增加了4個氟原子和 1個甲氧基[33]，是一種廣譜高效的殺菌劑。本研究證明氟吡菌胺與氟醚菌酰胺存在較強(qiáng)的正交互抗性，這對以后研究這兩種藥劑的作用機(jī)制或病菌的抗藥機(jī)制以及開展抗藥性治理具有重要的參考價(jià)值。由于馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺存在高度抗性風(fēng)險(xiǎn)，且氟吡菌胺與氟醚菌酰胺之間存在交互抗性，因此建議在應(yīng)用中避免氟吡菌胺與氟醚菌酰胺同時或交替使用，并限制此2種藥劑在同一生長季節(jié)的用藥次數(shù)不超過2次，應(yīng)與其他類藥劑（如烯酰嗎啉、嘧菌酯、雙炔酰菌胺、霜脲氰等）混用或交替使用，以減緩病菌抗藥性的產(chǎn)生。

翟明濤等[18]通過紫外誘導(dǎo)和藥劑馴化各獲得1個抗氟吡菌胺的辣椒疫霉突變體，并通過這2株突變體分析與其他藥劑的交互抗性，得出抗氟吡菌胺突變體與甲霜靈和霜脲氰之間存在交互抗性的結(jié)論，與本文結(jié)果不同，究其原因有以下兩點(diǎn)：第一，翟明濤的試驗(yàn)中獲得的抗性菌株數(shù)量少，得出結(jié)論的誤差可能性較大；第二，翟明濤的試驗(yàn)中直接通過2株突變體對不同藥劑的抗性倍數(shù)得出結(jié)論，與本文的比較方法不同。

當(dāng)前的馬鈴薯防治中，多次重復(fù)使用單一藥劑和隨意增加用藥量的現(xiàn)象普遍發(fā)生，這樣容易導(dǎo)致藥劑對病菌的選擇壓力居高不下，加快了抗性的產(chǎn)生。因此，應(yīng)當(dāng)混用和交替使用不同作用機(jī)理的農(nóng)藥，減小藥劑的選擇壓力，減緩抗性的產(chǎn)生，延長藥劑的使用壽命。

4 結(jié)論

氟吡菌胺與氟醚菌酰胺之間存在交互抗性，應(yīng)避免2種藥劑的混用或交替使用。根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)室建立的抗性風(fēng)險(xiǎn)量化評估標(biāo)準(zhǔn)，評估馬鈴薯晚疫病菌對氟吡菌胺存在高度抗性風(fēng)險(xiǎn)，在使用氟吡菌胺防治馬鈴薯晚疫病時應(yīng)控制同一生長季的使用次數(shù)不超過2次，并嚴(yán)格按照藥劑的推薦用量使用。

References

[1] 王希卓, 朱旭, 孫潔, 孫海亭, 張凱, 沈瑾. 我國馬鈴薯主糧化發(fā)展形勢分析. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2015(2): 52-55.

WANG X Z, ZHU X, SUN J, SUN H T, ZHANG K, SHEN J. The potato staple foods development situation analysis in China., 2015(2): 52-55. (in Chinese)

[2] 盧肖平. 馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的意義、瓶頸與政策建議. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) (社會科學(xué)版), 2015(3): 1-7.

LU X P. Strategy of potato as staple food: significance, bottlenecks and policy suggestions., 2015(3): 1-7. (in Chinese)

[3] Nowicki M, Foolad M R, Nowakowska M, Kozik E U. Potato and tomato late blight caused by: An overview of pathology and resistance breeding., 2012, 96(1): 4-17.

[4] Chowdappa P, Nirmal Kumar B J, Madhura S, Mohan Kumar S P, Myers K L, Fry W E, Cooke D. Severe outbreaks of late blight on potato and tomato in South India caused by recent changes in thepopulation.,2015, 64(1): 191-199.

[5] Fry W E, Goodwin S B. Re-emergence of potato and tomato late blight in the United States., 1997, 81(12): 1349-1357.

[6] 楊蘭芳, 吳德喜, 趙劍鋒, 任國敏, 陳齊斌. 不同殺菌劑對馬鈴薯晚疫病的田間防效試驗(yàn). 中國馬鈴薯, 2014, 28(3): 172-174.

YANG L F, WU D X, ZHAO J F, REN G M, CHEN Q B. Control efficacy of different fungicides on potato late blight in field., 2014, 28(3): 172-174. (in Chinese)

[7] 殷紅清, 吳承金, 瞿勇, 李大春. 不同藥劑對馬鈴薯晚疫病的防治效果. 植物保護(hù), 2012, 38(5): 179-183.

YIN H Q, WU C J, QU Y, LI D C. The control efficacy of different fungicides to potato late blight.,2012, 38(5): 179-183. (in Chinese)

[8] Toquin V, Barja F, Sirven C, Beffa R. Fluopicolide, a new anti-oomycetes fungicide with a new mode of action inducing perturbation of a spectrin-like protein//Kramer W, Schirmer U.. weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007: 675-682.

[9] Tafforeau S, Bardsley E, Latorse M P, Fabrèges C, SCHIRRINGS A, Wegmann T. Infinito: profile of a novel potato late blight fungicides. Summary of three years of development trials in Europe//Westerdijk C E, Schepers H T., 2006: 77-88.

[10] 楊吉春, 吳嶠, 劉允萍, 劉長令. 含氟農(nóng)藥開發(fā)的新進(jìn)展. 農(nóng)藥, 2011, 50(4): 289-295.

YANG J C, WU Q, LIU Y P, LIU C L. Recent advance of flourine-containing pesticides., 2011, 50(4): 289-295. (in Chinese)

[11] Bradshaw N J, Vaughan T B. The effect of phenylamide fungicides on the control of potato late blight () in England and Wales from 1978 to 1992., 1996, 45(2): 249-269.

[12] Davidse L C, Looijen D, Turkensteen L J, Van der Wal D. Occurrence of metalaxyl-resistant isolates ofin dutch potato fields.,1981, 87(2): 65-68.

[13] 羅彥濤, 孟潤杰, 趙建江, 韓秀英, 馬志強(qiáng), 王文橋, 張小風(fēng). 馬鈴薯晚疫病菌對不同藥劑敏感性及相應(yīng)藥劑田間防效驗(yàn)證. 農(nóng)藥, 2016, 55(2): 134-137.

LUO Y T, MENG R J, ZHAO J J, HAN X Y, MA Z Q, WANG W Q, ZHANG X F. Sensitivity to fungicides ofand controlling efficacy of corresponding fungicides against potato late blight., 2016, 55(2): 134-137. (in Chinese)

[14] Fishel F M, Dewdney M M. Fungicide resistance action committee’s (FRAC) classification scheme of fungicides according to mode of action.PI94. University of Florida. 2012.

[15] Kuck K H, Gisi U. FRAC mode of action classification and resistance risk of fungicides//Kramer W, Schirmer U.. weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007: 415-432.

[16] Wang W Q, Yan L, Meng R J, Zhao J J, Zhang X F, Han X Y, Ma Z Q. Sensitivity to fluopicolide of wild type isolates and biological characteristics of fluopicolide-resistant mutants in., 2014, 55: 119-126.

[17] Lu X H, Hausbeck M K, Liu X L, Hao J J. Wild type sensitivity and mutation analysis for resistance risk to fluopicolide in., 2011, 95(12): 1535-1541.

[18] 翟明濤, 王開運(yùn), 許輝, 唐劍鋒, 劉杰. 抗氟吡菌胺辣椒疫霉菌株的誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性的研究. 植物病理學(xué)報(bào), 2014, 44(1): 88-96.

ZHAI M T, WANG K Y, XU H,TANG J F, LIU J. Induction and characteristics ofisolates resistant to fluopicolide., 2014, 44(1): 88-96. (in Chinese)

[19] 閆磊. 黃瓜霜霉病菌對氟吡菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)研究[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

YAN L. Studies on risk of resistance into fluopicolide[D].Baoding: Agricultural University of Hebei, 2013. (in Chinese)

[20] 張志銘, 李玉琴, 田世民, 朱杰華, 王軍, 宋伯符. 中國發(fā)生馬鈴薯晚疫病菌 () A2交配型. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996, 19(4): 62-65.

ZHANG Z M, LI Y Q, TIAN S M, ZHU J H, WANG J, SONG B F. The occurrence of potato late blight pathogen () A2mating type in China.,1996, 19(4): 62-65. (in Chinese)

[21] Hohl H R, Iselin K. Isolates offrom Switzerland with A2 mating type behavior.,1984, 83(3): 529-530.

[22] 戚仁德, 汪濤, 李萍, 丁建成, 高智謀. 安徽省辣椒疫霉交配型的分布及在無性后代的遺傳. 植物病理學(xué)報(bào), 2012, 42(1): 45-50.

QI R D, WANG T, LI P, DING J C, GAO Z M.Distribution of mating types ofand inheritance in asexual progenies in Anhui Province., 2012, 42(1): 45-50. (in Chinese)

[23] GIsi U, Staehle-Csech U. Resistance risk evaluation of phenylamide and EBI fungicides., 1988: 359-366.

[24] Brent K J, Hollomon D W.Fungicide Resistance Action Committee, 2007.

[25] 趙衛(wèi)松. 辣椒疫霉對雙炔酰菌胺抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估及抗藥性生理生化機(jī)制研究[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

ZHAO W S. Risk evaluation of resistance to mandipropamid ofand studies on its physiological and biochemical mechanism[D]. Baoding: Agricultural university of Hebei, 2011. (in Chinese)

[26] van Tuyl J M.. H. Veenman & Zonen BV, 1977.

[27] 河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局. 馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測技術(shù)規(guī)程: DB13/T 1420-2011[S]. 2011-07-07[2016-05-06].

Hebeiprovincial Administration of Quality and Technical Supervision. Technological rules for detecting fungicide resistance inon potato. DB13T/1420-2011[S]. 2011-07-07[2016-05-06]. (in Chinese)

[28] 朱志峰. 馬鈴薯晚疫病菌對嘧菌酯的敏感性基線建立及其抗性風(fēng)險(xiǎn)初探[D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

ZHU Z F. Establishment of the baseline sensitivity ofto azoxystrobin and preliminary study on it’s resistance risk[D]. Changchun: Agricultural University of Jilin, 2007. (in Chinese)

[29] 侯淑英, 魏長拴, 徐擴(kuò), 朱杰華. 中國部分地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌寄生適合度的研究. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 28(2): 71-75.

HOU S Y, WEI C S, XU K, ZHU J H. Parasitic fitness ofisolates from some potato areas of China., 2005, 28(2): 71-75. (in Chinese)

[30] Kadish D, Cohen Y. Competition between metalaxyl-sensitive and metalaxyl-resistant isolates ofin the absence of metalaxyl., 1988, 37(4): 558-564.

[31] Cohen Y, Samoucha Y. Competition between oxadixyl-sensitive and-resistant field isolates ofon fungicide- treated potato crops., 1990, 9(1): 15-20.

[32] 王巖, 馮明鳴, 朱書生, 劉西莉. 黃瓜霜霉病菌烯肟菌酯敏感基線的建立及其室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 11(5): 25-29.

WANG Y, FENG M M, ZHU S S, LIU X L. Baseline-sensitivity and assessment of resistance risk ofto enostrobilurin.,2006, 11(5): 25-29. (in Chinese)

[33] 張化霜, 翟明濤, 王開運(yùn), 許輝, 唐劍鋒, 王紅艷. 新化合物氟醚菌酰胺的抑菌活性及其對棉花立枯絲核菌的作用方式研究. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 15(4): 405-411.

ZHANG H S, ZHAI M T, WANG K Y, XU H, TANG J F, WANG H Y. Study on fungicidal activity and mode of action of a novel fungicidal agent LH-2010A against.,2013, 15(4): 405-411. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 岳梅）

Acquisition and Biological Characteristics of Fluopicolide-resistant Isolates in

LUO Yan-tao1,2, MENG Run-jie1, ZHAO Jian-jiang1, HAN Xiu-ying1, MA Zhi-qiang1, WANG Wen-qiao1, ZHANG Xiao-feng1

(1Institute of Plant Protection, Hebei Academy of Agricultural&Forestry Sciences, Baoding 071000, Hebei;2College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objectives of this study are to research the cross resistance between fluopicolide and the other fungicides and assess the resistance risk ofto fluopicolide. 【Method】The fluopicolide-resistant mutants were acquired by UV irradiating sporangia, UV irradiating mycelia and fungicide taming. The mutation frequency was calculated, the resistance levels were measured, whether the resistance could be inherited stably under the condition of no fungicide after 10 generations was studied, the fitness (includingmycelial growth rates,sporulation capacity, andcomprehensive fitness index) on RSA medium and detached leaves were measured and the competitiveness of those resistant mutants and their parental isolates were studied. Cross resistance between fluopicolide and other fungicides were analyzed. The resistance risk ofto fluopicolide was assessed by the resistance risk quantitative evaluation criteria which was created by the authors’ lab. 【Result】Twenty-one fluopicolide-resistant mutants were acquired in this study. The resistance levels of those resistant mutants ranged from 61 to 3 157 and the mutation frequency of UV irradiating sporangia was 2.78×10-7. The fitness of most of the tested resistant mutants showed no significant difference with their respective parental isolates. In the test of competitiveness, among the 18 resistance frequency measurements of 1st, 3rd and 7th generations of two fluopicolide-resistant mutants, 3 were significantly lower than their parental isolates, 4 were significantly higher than their parental isolates, while the other 11 showed no difference. The resistance of all those 21 fluopicolide-resistance mutants could be inherited stably. The resistance of all those 21 fluopicolide-resistance mutants could be inherited stably. The correlation coefficient () between the lgEC50of the fluopicolide-resistant mutants and the fluopicolide-sensitive isolates to fluopicolide and the lgEC50of those isolates to azoxystrobin, pyraclostrobin, cymoxanil, dimethomorph, mandipropamid, metalaxyl and fluoride ether bacteria amide were 0.104 (=0.654), 0.311 (=0.170), 0.228 (=0.081), 0.376 (=0.093), 0.214 (=0.351), 0.122 (=0.599), 0.963 (=0.000). The inherent resistance risk value ofto fluopicolide was 15.【Conclusion】The cross-resistance relationship was found between fluopicolide and fluoride ether bacteria amide. No cross-resistance relationship was found between fluopicolide and azoxystrobin, pyraclostrobin, cymoxanil, dimethomorph, mandipropamid and metalaxyl. There could be high inherent risk ofdeveloping resistance to fluopicolide. The risk management ofto fuopicolide should be enhanced. It is suggested that the fluopicolide should be used alternately or in mixture with other not cross-resistant fungicides.

; fluopicolide; resistant mutants; biological characteristics; cross resistance; inherent risk

2016-05-06；接受日期：2016-08-10

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303018，201303023）

羅彥濤，E-mail：yantaoluo@sina.cn。通信作者王文橋，Tel：0312-5915659；E-mail：wenqiaow@163.com。通信作者張小風(fēng)，E-mail：zbs1103@163.com