去甲斑蝥素對人真皮淋巴管內皮細胞體外三維培養淋巴管生成的影響及其機制

袁小建 李顯明 章功年 金東輝 肇恒飛 蘇志偉 范躍祖

去甲斑蝥素對人真皮淋巴管內皮細胞體外三維培養淋巴管生成的影響及其機制

袁小建 李顯明 章功年 金東輝 肇恒飛 蘇志偉 范躍祖

目的 探討去甲斑蝥素（NCTD）對人真皮淋巴管內皮細胞（HDLEC）體外三維培養淋巴管生成的影響及機制。方法建立HDLEC體外培養淋巴管生成模型，隨機分為NCTD組（加1/3 IC50NCTD 40 nM）與空白對照組，作用24 h，觀察兩組淋巴管生成的形態變化；并采用免疫細胞化學、Western blot試驗和qPCR技術測定比較兩組淋巴管生成因子（VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3）蛋白和基因表達。結果 NCTD組的HDLEC細胞形態發生改變，很少形成管狀結構，時間延長后細胞出現變圓、離壁、浮起、死亡；且NTCD組淋巴管生成（10.9±2.3）個，明顯少于空白對照組（68.4±5.2）個（P＜0.01）。免疫細胞化學染色、Western blot試驗結果顯示，NCTD對HDLEC三維培養淋巴管生成中的VEGF-C和VEGF-D的蛋白表達下調（P＜0.01）。qPCR檢測顯示，NCTD對VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的基因表達明顯降低（P＜0.01）。結論 NCTD對通過下調淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D的蛋白和基因表達，產生抗淋巴管生成的作用。

去甲斑蝥素 人真皮淋巴管內皮細胞 三維培養 抗淋巴管生成

腫瘤細胞通過淋巴管轉移是腫瘤擴散的主要途徑，但是淋巴管生成過程、作用和機制尚不清楚。去甲斑蝥素（NCTD）是用于治療癌癥的傳統中藥，其抗淋巴管生成作用的靶點與機制如何，尚待進一步研究。本研究通過人真皮淋巴管內皮細胞（HDLEC）三維培養體外模擬淋巴管生成過程，觀察NCTD對淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3蛋白和基因表達的影響，以探討NCTD抗淋巴管生成的相關分子機制，為腫瘤抗淋巴管生成治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 HDLEC（美國Sciencell公司），人纖維蛋白原（北京拜德生物有限公司），人凝血酶（美國Sigma公司），NCTD（H20064531，江蘇康希制藥有限公司），兔抗人VEGF-C抗體（美國invitrogen公司）；兔抗人VEGF-D抗體（美國Abcam公司），兔抗人VEGFR-3抗體（美國Cell Signaling公司），GAPDH（美國Abcam公司），S-P試劑盒、免疫組化試劑盒（上海晶美生物技術有限公司），Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司），PCR引物（上海Sangon公司），Real-time PCR試劑盒（大連Takara公司），cDNA逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司），蛋白預染Marker（SM0671，美國Fermentas公司），顯影粉、定影粉和X光膠片（上海冠龍公司）。

1.2 纖維蛋白凝膠制備和細胞培養 依據相關文獻[1-2]，用PBS溶解人纖維蛋白原（3 mg/ml）和人凝血酶（50 U/ml），在6孔培養板中制備纖維蛋白凝膠，先后加入500 μl纖維蛋白原、100μl內皮細胞培養液和10μl凝血酶溶液凝固，37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養箱中30min，纖維蛋白原凝膠形成膠凍狀。將培養好的HDLEC（第五代細胞）懸液各取300μl注入凝膠表面（細胞濃度1×105ml），靜置1h后加入內皮細胞培養液2ml，37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養箱培養，2d更換培養液1次，每天通過倒置光顯微鏡觀察細胞生長及體外淋巴管生成情況。

HDLEC在體外纖維蛋白凝膠培養1周左右，隨機分為空白對照組與NCTD組（加1/3 IC50NCTD 40nM）[2]，繼續培養24h，觀察形態變化。HDLEC（第五代細胞）培養1周后開始形成淋巴管生成管狀結構，隨機分為空白對照組與NCTD組（同上），作用24h，應用免疫細胞化學、Western blot試驗、qPCR檢測HDLEC體外模擬淋巴管生成過程中，NCTD對VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和基因表達的影響。

1.3 qPCR檢測 根據Trizol試劑盒指示提取細胞總RNA。通過cDNA逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，并進行PCR擴增，隨后進行定量PCR檢測。PCR反應擴展條件：95℃30s，95℃5s，60℃30s，共40個循環。引物為VEGF-C，5′-AGTCGCGACAAACACCTTCT-3′（正義）和5′-GTAGCTCGTGCTGGTGTTCA-3′（反義）；VEGF-D，5′-CAGTGGGTTGATCTGGGACT-3′（正義）和5′-CATGCAGGGTAGGATGGTCT-3′（反義）；VEGFR-3，5′-CGGCTTCAGCTGTAAAGGAC-3′（正義）和5′-GCCTCCAAGGAGTAAGACCC-3′（反義）；GAPDH，5′-GCCTCCAAGGAGTAAGACCC-3′（正義）和5'-TGTGAGGAGGGGAGATTCAG-3′（反義）。使用ABI7900HT序列檢測系統（美國Applied Biosystems公司）自帶軟件分析數據，所有樣品一式兩份。GAPDH作為每個樣本測定的CT值和mRAN相對表達量的內部參照，使用比較循環閾值（2-2-△△CT）方法計算基因表達量。

1.4 Western blot試驗 按照試劑盒說明書操作裂解細胞，提取蛋白放置包含有50 mM Tris（pH 7.4）、150mM氯化鈉、1%的Trit nX-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉和蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中。參照相關文獻[3]將兔抗人VEGF-C和-D和VEGFR-3抗體進行免疫印跡試驗。用Odyssey紅外成像系統（美國LI-COR Biosciences公司）進行蛋白條帶顯現，使用Odyssey軟件計算相對于GAPDH的熒光強度。運用Image Pro Plus軟件確定VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達的積分光密度（IOD）。

1.5 免疫細胞化學染色 免疫細胞化學染色采用生蛋白鏈菌素-過氧化物酶（S-P）方法進行。HDLEC接種在浸漬35 mm培養皿纖連蛋白涂覆的玻璃蓋玻片上，隨機分為空白對照組與NCTD組，作用24h，取出蓋玻片，甲醇與丙酮溶液1∶1固定，自然風干后，-20℃冰箱內保存，用S-P法對細胞片進行免疫細胞化學染色，以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性。染色結果用Image Pro Plus（美國Media Cybernetics公司）測定IOD。

1.6 統計學處理 使用SPSS13.0統計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 NCTD對HDLEC體外模擬淋巴管生成的影響24h后，可見空白對照組的HDLEC細胞形成圓形或橢圓形、類環狀或多環中空管道樣“淋巴管生成”雛形結構，見圖1；NCTD組HDLEC細胞形態發生改變，很少形成管狀結構，時間延長后細胞出現變圓、離壁、浮起、死亡。隨機取5個顯微鏡視野（×200），觀察并計算淋巴管生成個數，重復3次取均值，NTCD組淋巴管生成（10.9±2.3）個，明顯少于空白對照組（68.4±5.2）個（P＜0.01）。

圖1 顯微鏡下可見（作用24h后，空白對照組可見HDLEC細胞形成多個圓形或橢圓形、類環狀或多環中空管道樣“淋巴管生成”雛形結構；NCTD組可見HDLEC細胞形成“淋巴管生成”雛形結構的能力減弱，HDLEC細胞聚集浮起，固縮碎裂，凋亡壞死。纖維蛋白凝膠三維培養，相差倒置光學顯微鏡，×200）

2.2 NCTD對HDLEC在體外模擬淋巴管生成過程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白和mRNA表達的影響 qPCR結果顯示，NCTD能明顯降低HDLEC在體外模擬淋巴管生成過程中的VEGF-C（2.41%±0.11%，7.44%±0.11%）、VEGF-D（16.08%±1.12%，27.28%±1.22%）和VEGFR-3（0.95%±0.02%，3.40%±0.02%）的基因表達（P＜0.01）。免疫細胞化學染色結果顯示，NCTD能明顯降低VEGF-C（0.088±0.011，0.141±0.014）和VEGFD（0.084±0.008，0.138±0.012）的蛋白表達（P＜0.01）；但NCTD組與空白對照組在VEGFR-3（0.130±0.006，0.140± 0.017）的蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。Western blot試驗顯示，NCTD能明顯降低VEGFC（10 183.9±3 382.9，24 892.4±1 540.0）和VEGF-D（10 518.4±3 306.1，27 898.2±1 741.3）的蛋白表達，而兩組對VEGFR-3（33579.0±1589.2，39396.9±3 746.3）的蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 NCTD對HDLEC體外模擬淋巴管生成過程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的蛋白表達的影響（免疫細胞化學染色）

圖3 NCTD對HDLEC外模擬淋巴管生成過程中VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白表達的影響（Western blot試驗）

3 討論

淋巴管生成對于胚胎期淋巴系統的發育與成體中淋巴管的再生十分重要。一般來說，血管生成總是伴隨著淋巴管生成；而腫瘤中存在血管生成，那么可能存在淋巴管生成。2001年首次在動物模型中證實腫瘤淋巴管生成[4-6]。前期研究表明NCTD能明顯抑制膽囊和膀胱腫瘤細胞的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3蛋白水平和基因水平的表達[7-8]。本研究建立了HDLEC體外三維培養淋巴管生成模型，相差光學顯微鏡觀察到HDLEC在纖維蛋白凝膠三維培養基中形成圓形、橢圓形、類環狀或多環中空管道樣的“淋巴管生成”雛形結構；而淋巴管狀結構的形成與HDLEC增殖、遷移、行走密切相關[2]。本實驗應用NTCD后，淋巴管生成個數明顯減少，HDLEC形態發生改變，很少形成管狀結構，時間延長后HDLEC細胞聚集、浮起，固縮碎裂，淋巴管狀結構斷裂、破壞，細胞凋亡壞死。這表明NCTD不僅能顯著抑制HDLEC三維培養體外模擬形成“淋巴管生成”，而且對已形成的淋巴管狀結構有明顯的抑制破壞作用。

目前，NCTD已廣泛應用于臨床抗腫瘤治療，但迄今尚未見應用于抗腫瘤淋巴管生成方面的報道。本實驗通過培養HDLEC建立體外模擬淋巴管生成模型，觀察NCTD對HDLEC的直接殺傷和凋亡誘導作用，以及對淋巴管生成因子蛋白和mRNA表達的影響，以研究NCTD抗HDLEC淋巴管生成的作用與機制。通過免疫細胞化學、Western blot試驗和qPCR檢測發現，NCTD可使HDLEC體外三維培養模擬淋巴管生成過程中的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3在蛋白和mRNA水平表達均明顯下調。NCTD的抗HDLEC淋巴管生成作用，可能與其直接抑制淋巴管內皮細胞的增殖、遷移，誘導其凋亡，在蛋白和mRNA水平下調淋巴管生成因子VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的表達，阻斷VEGFC、VEGF-D和VEGFR-3的信號通道等有關。

前期研究表明，NCTD能有效抑制腫瘤細胞的VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3表達[7-8]。本實驗直接針對淋巴管內皮細胞、HDLEC體外三維培養模擬淋巴管生成和淋巴管生成過程中的VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達進行研究，為NCTD靶向性抗腫瘤淋巴管生成和阻斷VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3信號通道提供實驗依據與“抗腫瘤淋巴管生成”作用靶點。此外，能否真正抑制惡性腫瘤所誘導的淋巴管生成，有待在荷瘤動物淋巴管生成抑制實驗中進一步驗證；NCTD與VEGFR-3抗體在抗腫瘤淋巴管生成方面是否協同作用、機制如何，需進一步探討。

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Inhibitory effect of norcantharidin on human dermal lymphatic endothelial cell in three-dimensional culture

YUAN Xiaojian,LI Xianming，ZHANG Gongnian,et al.Department of Surgery,Jiaxing Maternal and Child Health Hospital,Jiaxing 314000,China

Objective To study the effect of norcantharidin(NCTD)on human dermal lymphatic epithelial cell(HDLEC)in three-dimensional culture and related molecular mechanisms. Methods Three dimensional model of lymphangiogenesis with HDLEC was established to mimic lymphatic capillary-like structures in vitro.The three-dimensional cultured HDLEC were randomly assigned to control group(no NCTD)and NCTD group(cultured with 40 nm NCTD)for 24 h.The morphological changes were observed by inverted microscope,the expressions of VEGF-C,VEGF-D,VEGFR-3 protein and MicroRNA in threedimensional cultured HDLEC were measured by immunohistochemistry,western-blot and qPCR. Results The lymphangiogenesis model in vitro was established successfully by three-dimensional culture of HDLEC.The inhibitory effects of NCTD on lymphangiogenesis in vitro were observed.Compared to control group,the expression of VEGF-C and VEGF-D proteins in NCTD group was significantly down-regulated as showed by immunohistochemistry and Western-blot(P＜0.01),The MicroRNA expression of VEGF-C,VEGF-D and VEGFR-3 in NCTD group was significantly decreased as shown by qPCR(P＜0.01). Conclusion Norcantharidin inhibits lymphangiogenesis by down-regulating the expression of VEGF-C and VEGF-D,suggesting that it might be an effective agent for targeting anti-lymphangiogenesis.

Norcantharidin Lymphatic endothelialcellThree-dimensionalAnti-lymphangiogenesis

2015-02-12）

（本文編輯：陳丹）

314000 嘉興婦幼保健院外科（袁小建、李顯明、章功年、金東輝、肇恒飛、蘇志偉，袁小建系同濟大學醫學院2006級在職研究生）；上海同濟大學附屬同濟醫院外科（范躍祖）

袁小建，E-mail：hyyxj2003@163.com