FTY720對顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡的抑制作用

蔡建勇 林群 巴華君 陸川 陳獻東 陳茂華 孫軍

●論 著

FTY720對顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡的抑制作用

蔡建勇 林群 巴華君 陸川 陳獻東 陳茂華 孫軍

目的 探討FTY720對顱腦損傷大鼠海馬組織神經細胞凋亡的抑制作用。方法 30只大鼠隨機分成假手術組、模型組和治療組，每組10只，采用改進的Feeney自由落體損傷裝置建立大鼠顱腦損傷模型，假手術組大鼠切開頭皮，顱骨鉆孔后縫合頭皮，不作外力打擊。治療組大鼠按1mg/kg劑量予FTY720腹腔注射，其他組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1ml。24h后斷頭處死大鼠，分離海馬組織，采用TUNEL法檢測凋亡神經細胞，Western-blotting檢測pro-caspase 3/9蛋白表達，四肽熒光底物法檢測caspase-3/9蛋白活性。結果 模型組大鼠海馬組織凋亡神經細胞比例、pro-caspase 3/9蛋白表達和caspase-3/9蛋白活性較假手術組顯著升高，而治療組大鼠海馬組織凋亡神經細胞比例、pro-caspase 3/9蛋白表達和caspase-3/9蛋白活性較模型組顯著下降。結論 FTY720可顯著抑制顱腦損傷大鼠海馬組織神經細胞凋亡，具有腦保護作用。

FTY720 大鼠 神經細胞凋亡 腦保護作用

免疫反應是顱腦損傷后繼發性腦損傷機制的重要組成部分[1]。FTY720是一種新型的免疫抑制劑，是將冬蟲夏草抽提物中具有免疫抑制作用的成份ISP-I進行結構改造而成的，在體內代謝為具有生物活性的物質而發揮作用。其免疫抑制具有雙向調節作用，在體內抑制免疫反應發生的同時不破壞機體對病毒的免疫應答及免疫記憶能力，不良反應少，生物利用度高[2]。目前，FTY720用于治療多發性硬化癥已進入Ⅱ期臨床試驗，治療腎移植排斥反應已進入Ⅲ期臨床研究階段[3]。筆者采用FTY720腹腔注射治療大鼠顱腦損傷，觀察其對大鼠海馬組織神經細胞凋亡的抑制作用，從而評價其腦保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Wistar大鼠（中國科學院上海實驗動物中心），體重250～300g，雄性，清潔級；FTY720（美國Biovision公司）臨用時根據1mg/kg用量以0.9%氯化鈉溶液配成1ml注射液；TUNEL試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；caspase-3/9蛋白活性檢測試劑盒（美國Livemore公司）；小型垂直電泳槽（型號：164-8001，美國Biorad公司）；轉印槽（型號：Trans-Blot，美國Biorad公司）；脫色搖床（型號：TY-80B，常州澳華儀器有限公司）；電泳儀（型號：EPS-200，上海天能科技有限公司）；低溫高速離心機（型號：BECKMAN，北京普瑞麥迪實驗室技術有限公司）。

1.2 方法 將30只大鼠隨機分成假手術組、模型組和治療組，每組10只。予50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，在右側冠狀縫后1mm、中線旁開2mm處切開頭皮，鉆一直徑5mm骨孔，采用改進的Feeney自由落體損傷裝置，用40g重的擊錘從25cm處自由墜落沖擊撞桿，打擊深度5 mm，縫合頭皮。假手術組大鼠切開頭皮，顱骨鉆孔后縫合頭皮，不作外力打擊。假手術組和模型組大鼠手術操作完成前或模型形成前0.5h予0.9%氯化鈉注射液1ml腹腔注射，治療組大鼠模型形成前0.5h按1mg/kg劑量予FTY720腹腔注射；24h后，大鼠以80 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，斷頭處死，分離海馬組織。

1.3 細胞凋亡檢測 采用TUNEL法檢測大鼠海馬組織凋亡神經細胞，細胞核染色呈棕黃色或棕紅色定義為細胞染色陽性，在Olympus-CH光學顯微鏡下計算10個高倍鏡視野，每個視野計數100個細胞，總計1 000個細胞，計算平均凋亡率（%）。

1.4 pro-caspase 3/9蛋白的檢測 采用Western-blotting檢測大鼠海馬組織pro-caspase 3/9蛋白的表達。取部分組織按1∶10（密度：體積）加入細胞裂解液，冰上勻漿，13 000 g離心20min收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白（20～50μg）經12%SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1h；加入相應山羊抗大鼠一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP標記的兔抗大鼠二抗（1∶10 000）室溫搖床孵育1h，TBST洗膜3次；ECL試劑作用5min，X光膠片曝光。沖洗并掃描后結果用quality one軟件分析雜交條帶灰度值，以GAPDH水平為內對照，比較相對灰度值。

1.5 caspase-3/9蛋白活性的檢測 采用四肽熒光底物法檢測caspase-3/9蛋白活性。取腦組織勻漿100μl與caspase-3底物AC-DEVD-AMC和caspase-9底物ACLEHD-AFC混合反應，采用熒光分光光度計測定其熒光強度，以未加腦組織時的熒光強度為參照值，計算熒光強度，最終比較相對熒光強度。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較應用單變量方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 FTY720對神經細胞凋亡的影響 假手術組神經細胞凋亡率為（7.1±1.7）%，模型組為（23.5±3.2）%，治療組為（16.7±2.3）%，假手術組大鼠海馬組織神經細胞凋亡率不高，模型組大鼠海馬組織神經細胞凋亡率顯著升高，而治療組大鼠海馬組織神經細胞凋亡率較模型組顯著下降（均P＜0.001），詳見圖1。

圖1 FTY720對神經細胞凋亡的影響（TUNEL法，×100）

2.2 FTY720對pro-caspase 3/9蛋白表達的影響 顱腦損傷后，大鼠海馬組織pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表達明顯增加，使用FTY720后，這些蛋白表達明顯回調（均P＜0.001），詳見圖2和表1。

2.3 FTY720對caspase 3/9蛋白活性的影響 顱腦損傷后，大鼠海馬組織caspase 3和caspase 9蛋白活性明顯增加，使用FTY720后，這些蛋白活性明顯下降（均P＜0.001），詳見表2。

3 討論

顱腦損傷發生率高，預后不佳。顱腦損傷后腦組織局部免疫應答增強加重腦組織的繼發性腦損傷[1]，為臨床應用免疫抑制療法治療顱腦損傷提供一定的實驗依據。但另一方面，臨床上顱腦損傷患者有50%～70%合并繼發性感染，而應用常規免疫抑制劑可致全身免疫功能低下，加重繼發性感染[4]。因此尋找一種安全有效的免疫抑制劑對于減少顱腦損傷后繼發性腦損傷具有重要意義。

圖2 FTY720對pro-caspase 3/9蛋白表達的影響

表1 FTY720對pro-caspase 3/9蛋白表達的影響

FTY720是一種新合成的免疫抑制劑，為鞘氨醇-1-磷酸鹽（S1P）受體阻滯劑[5]。在細胞內FTY720被鞘氨醇激酶2磷酸化為具有生物活性的（S）-FTY720-P異構體而發揮作用。（S）-FTY720-P與5種1-磷酸鞘氨醇受體中的S1P1、S1P4、S1P5有高的親合力，與S1P3有低的親合力，不與SlP2結合。根據1-磷酸鞘氨醇受體亞型和靶細胞/組織的不同，FTY720功能表現為拮抗或激動[6]。FTY720主要用于抑制器官移植所引起的排斥反應，還可以用于治療皮炎、重癥肌無力等免疫紊亂/障礙疾病及某些轉移性癌癥[7]。

pro-caspase 3和pro-caspase 9是凋亡蛋白caspase 3和caspase 9的無活性前體形式，當受到凋亡信號刺激后，會酶解成caspase 3和caspase 9活性二聚體形式。其中蛋白caspase 3為凋亡執行者，可直接降解胞內結構蛋白和功能蛋白，引起凋亡；而caspase 9是凋亡啟動者，受到凋亡信號刺激后，caspase 9自剪接激活，引起caspase級聯反應[8-10]。目前動物實驗中FTY720用于腦損傷治療的劑量均選用1mg/kg，且一般在腦損傷動物模型形成前短時間內腹腔或靜脈注射使用[11-13]。既往動物研究證實神經細胞凋亡一般在腦損傷后24～72h達到高峰[8-10]，且有關FTY720用于腦損傷治療的研究也一般選擇在腦損傷后24h進行神經功能評價和腦組織取樣[11-13]。基于以上因素，本研究在腦外傷模型形成前短時間（0.5h）內采用1mg/kg FTY720腹腔注射治療腦損傷大鼠，且神經細胞凋亡檢測的時間選擇在外傷后24h。本實驗檢測顱腦損傷后大鼠海馬神經細胞凋亡、procaspase 3和pro-caspase 9蛋白表達和caspase 3和caspase 9蛋白活性后發現，顱腦損傷后pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表達增加，caspase 3和caspase 9蛋白活性增強，且凋亡神經細胞比例增高，表明顱腦損傷后腦內發生凋亡；給予FTY720處理后，神經細胞凋亡、pro-caspase 3和pro-caspase 9蛋白表達和caspase 3和caspase 9蛋白活性表現出不同程度的回調，顯示FTY720可降低顱腦損傷后凋亡的發生。最近有研究顯示，FTY720可抑制體外培養膠質細胞的炎性因子釋放[14]，阻止腦外傷大鼠外傷皮層炎性細胞的聚集，從而降低腦炎癥反應[15]。FTY720可以抑制動物腦出血后腦內淋巴細胞浸潤[11]，也能有效抑制短暫性腦缺血導致的大鼠神經細胞死亡[12]和降低腦出血大鼠腦水腫，改善腦功能[13]。也有研究發現，FTY720用于治療腦缺血后大鼠的同時并沒有提高機體的細菌感染率[16]。目前，少有研究揭示FTY720對顱腦損傷后神經細胞凋亡及caspase 3/9通路的影響，本研究揭示了FTY720對顱腦損傷大鼠神經細胞凋亡的抑制作用。既往研究提示FTY720可顯著抑制中樞神經系統炎癥反應[14－15]。因此，筆者推測FTY720可能通過抑制腦炎癥反應，從而抑制神經細胞凋亡，改善顱腦損傷導致的神經功能障礙，而且安全可靠。然而，藥效往往與用藥時間和用藥劑量密切相關，本研究沒有進一步分析不同劑量FTY720和不同時間點用藥對神經細胞凋亡的抑制作用，這方面的數據需要今后深入研究。

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Inhibitory effect of FTY720 on cell apoptosis of neurons in rats with experimental traumatic brain injury

CAI Jianyong,LIN Qun, BA Huajun,et al.Department of Neurosurgery,Wenzhou Central Hospital,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of FTY720 on cell apoptosis in hippocampus of rats with experimental traumatic brain injury. Methods Thirty rats were randomly divided into sham-operation group,model group and treatment group with 10 in each.Modified Feeney free fall injury device was used to induce craniocerebral injury in rats of model and treatment groups.Rats in sham-operation group underwent scalp incision,cranial drilling and scalp suture,but no traumatic impact.Rats in treatment group were administrated intraperitoneally with 1 mg/kg FTY720.Rats in other two groups were given an intraperitoneal injection of 1 mL normal saline.After 24 hours,rats were sacrificed by decapitation and their hippocampus tissues were dissected.TUNEL staining,Western-blotting and four peptide fluorescence substrate method were used to determine the apoptotic neuronal cells,expressions of pro-caspase 3/9 proteins and activities of caspase 3/9 proteins,respectively. Results Compared with sham-operation group,the percentage of apoptotic neuronal cells,expressions of pro-caspase 3/9 proteins and activities of caspase 3/9 proteins were significantly elevated in the hippocampus of model group;while these indicators in treatment group were significantly lower than those of model group. Conclusion FTY720 can markedly suppress cell apoptosis of hippocampus neurons in rats after trauma brain injury and shows cerebral protective effect.

FTY720 RatNeuronalcellapoptosis Cerebralprotective effect

2015-11-21）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省實驗動物科技計劃項目（2014C37029）

325000 溫州市中心醫院神經外科

蔡建勇，E-mail：cjy19761976@126.com