康復新液治療復發性口腔潰瘍的作用機制研究

張存寶 孫莉 張雄 王永武 方翔 高莉萍

康復新液治療復發性口腔潰瘍的作用機制研究

張存寶 孫莉 張雄 王永武 方翔 高莉萍

目的 探討康復新液治療復發性口腔潰瘍（ROU）的作用機制，以期為臨床用藥提供指導。方法 將90例ROU患者隨機分為觀察組和對照組，各45例，觀察組患者給予康復新液聯合干擾素-α2b治療，對照組僅給予干擾素-α2b。另擇同期無ROU病史的健康成年人45例為正常組。采用熒光定量PCR檢測觀察組和對照組患者治療前后口腔鏈球菌、韋榮菌、奈瑟菌的變化，采用流式細胞術檢測觀察組和對照組患者治療前后外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例的變化，將結果均與正常組比較；同時，比較治療后觀察組和對照組的療效。結果 治療前，觀察組和對照組患者口腔鏈球菌、韋榮菌含量及外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例均明顯低于正常組（均P＜0.05）；治療后，兩組患者鏈球菌、韋榮菌含量及CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例均較治療前明顯提高（均P＜0.05），但對照組均仍低于觀察組和正常組（均P＜0.05），而觀察組與正常組比較均無統計學差異（均P＞0.05）。治療后，觀察組療效總有效率高于對照組（91.11%vs 73.33%，P＜0.05）。結論 康復新液治療ROU的作用機制可能與口腔鏈球菌及韋榮菌含量的增加及外周血T淋巴細胞亞群比例的改善有關。

康復新 復發性口腔潰瘍 鏈球菌 韋榮菌 T淋巴細胞亞群

復發性口腔潰瘍（recurrent oral ulcers，ROU）是口腔黏膜疾病中最常見的潰瘍類疾病，人群患病率達20%[1-2]。本病病因不明，周期性發作，呈自限性；有局限性口腔黏膜潰瘍性損傷的特點，常表現為進食、說話時疼痛，影響患者工作、生活，且長期潰瘍不愈易出現惡變；目前尚無特效治療方法，臨床常采用對癥治療。康復新液系美洲大蠊提取物制成的純天然制劑,含有多種生物活性物質如多元醇、粘糖氨酸、粘氨酸和多種氨基酸。已有研究表明，康復新液具有抗感染、促進肉芽組織生長、促進血管生成、改善創面微循環、消除炎癥水腫、修復潰瘍創面的功效，并具有激活免疫系統、增強細胞免疫的作用，臨床上可用其治療ROU，療效顯著，但作用機制尚不明確[3-6]。基于此，本研究采用康復新液治療ROU患者，通過觀察患者治療前后口腔微生態及外周血T細胞亞群比例的變化探討其作用機制，以期為臨床用藥提供理論參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2010年5月至2014年3月在本院口腔科就診的ROU患者90例，均處于潰瘍期，按隨機數字表法分為觀察組和對照組，各45例，另擇同期無ROU病史的健康成年人45例作為正常組。納入標準：患者研究開始前1周未服用任何抗生素、鉍劑、抗酸劑及H1受體拮抗劑；1個月內未服用類固醇藥物或非類固醇類抗炎藥，如阿司匹林等；無其他系統性疾病；無其他口腔黏膜病；無中、重度牙周病。觀察組男28例，女17例，年齡32.7～22.5（27.5±6.3）歲；對照組男26例，女19例，年齡32.7～20.9（26.8±5.9）歲；正常組男23例，女22例，年齡30.3～20.9（25.6±4.7）歲。3組間性別、年齡比較均無統計學差異（均P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，征得患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 觀察組患者予康復新液（昆明賽諾制藥有限公司，50ml/瓶）10ml噴于口腔潰瘍面上，并在口內保持10s后咽下，3次/d；同時在治療的第1天和第5天給予干擾素-α2b（哈藥集團生物工程有限公司，100萬 U/支）100萬U肌肉注射，1次/d，10d為1個療程。對照組患者不予康復新液治療，但接受與觀察組相同的干擾素-α2b治療方案治療。正常組研究期間停用其他藥物。

1.2.2 唾液標本檢測 觀察組和對照組患者在治療前后分別采集唾液標本1次，正常組研究期間僅采集唾液標本1次；標本采集前2h均未進食，用無菌潔凈玻璃器皿采集各組患者輕漱口后唾液約1ml，每份用無菌移液器平均分裝成2份于無菌EP管中，置于4℃冰箱中保存備用。其中1份標本直接取10μl涂片，室溫下自然風干約20min；放置于95%乙醇中固定3min，革蘭染色；觀察唾液菌群，進行計數。另1份標本按照需氧菌、厭氧菌培養環境進行細菌培養后進行以下檢測。

1.2.2.1 唾液標本DNA及鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌16S rRNA基因PCR擴增 采用改良CTAB/NaCI法提取標本DNA及培養出的細菌。在Oligo7.0上設計鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌16S rRNA基因的特異性引物（上海生工有限公司合成），見表1。分別以鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌DNA擴增后純化回收的產物為陽性對照，滅菌去離子水為空白對照，提取的標本DNA為檢測模板，進行PCR擴增驗證引物特異性。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳。PCR產物回收純化后進行測序。同時采用紫外線分光光度計檢測PCR產物的純度及濃度，制備各菌的標準品。

表1 鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌16S rRNA基因的特異性引物及產物片段大小

1.2.2.2 熒光定量PCR 反應體系：DNA模板1μl、2xTrans Start Top Green qPCR SuperMix10μl，引物 1（10μmol/L）0.6μl、引物2（10μmol/L）0.6μl、Passive Reference Dye 0.4μl、ddH2O 7.4μl（均購于北京全式金有限公司）。反應在ABI7500熒光定量PCR儀中進行，程序為95℃預變性3min，95℃10s，退火溫度20s，72℃30s，40個循環；同時進行溶解曲線的分析，程序為60℃1min，95℃30s。在ABI7500分析軟件上得出鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌的Ct值，分別以這3種球菌的拷貝數 [拷貝數/ ml=（6.02×1023）×（g/ml）/（DNA長度×660）]為橫坐標，Ct值為縱坐標，繪制絕對定量標注曲線。

1.2.3 血液標本檢測 觀察組和對照組患者在治療前后分別采集外周血標本1次，正常組研究期間僅采集外周血標本1次；采用流式細胞術檢測CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例的變化。

1.3 療效評價 參照中華口腔醫學會口腔黏膜病專業委員會制定的ROU評價試行標準評價療效。（1）顯效：疼痛消失，用藥后3d內潰瘍愈合，自身對照潰瘍復發間隙延長。（2）有效：疼痛減輕，用藥5d潰瘍愈合，自身對照潰瘍復發間隙延長。（3）無效：用藥1周后癥狀和體征無改善。

1.4 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件。計量資料以表示，治療前后鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌的含量及CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例3組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內治療前后比較采用配對t檢驗。計數資料以構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 唾液標本PCR擴增產物電泳圖 見圖1。

圖1 PCR擴增產物電泳圖（M為DNA marker，1為陰性對照，2～4依次為鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌陽性對照，5～7依次為鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌16S rRNA基因引物擴增產物）

2.2 鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌的熒光定量PCR擴增曲線、溶解曲線和標準曲線 見圖2-4。

由圖2-4可見，鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌都具有很好的擴增效率和高度的反應特異性。

圖2 熒光定量PCR擴增曲線（a：鏈球菌；b：韋榮菌；c：奈瑟菌）

圖3 熒光定量PCR溶解曲線（a：鏈球菌；b：韋榮菌；c：奈瑟菌）

圖4 熒光定量PCR標準曲線（a：鏈球菌；b：韋榮菌；c：奈瑟菌）

2.3 觀察組、對照組和正常組鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌定量結果的比較 見表2。

由表2可見，治療前，觀察組和對照組患者口腔中鏈球菌和韋榮菌的含量比較均無統計學差異（均P＞0.05），且均低于正常組（均P＜0.05）。治療后，觀察組和對照組鏈球菌和韋榮菌的含量均較治療前提高（均P＜0.05），但觀察組均明顯高于對照組（均P＜0.05），且與正常組比較均無統計學差異（均P＞0.05）；而對照組鏈球菌和韋榮菌的含量仍低于正常組（均P＜0.05）。治療前后組間、組內奈瑟菌含量比較均無統計學差異（均P＞0.05）。

2.4 觀察組、對照組和正常組CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例的比較 見表3。

由表3可見，治療前，觀察組和對照組患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例比較均無統計學差異（均P＞0.05），且均明顯低于正常組（均P＜0.05）。治療后，3者在觀察組和對照組中的比例均較治療前提高（均P＜0.05），但觀察組均高于對照組（均P＜0.05），且與正常組比較均無統計學差異（P＞0.05），而對照組仍均明顯低于正常組（均P＜0.05）。

表2 觀察組、對照組和正常組鏈球菌、韋榮菌及奈瑟菌定量結果的比較（拷貝/ml）

表3 觀察組、對照組和正常組CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例的比較（%）

2.5 觀察組和對照組患者臨床療效的比較 見表4。

表4 觀察組和對照組患者臨床療效的比較[例（%）]

由表4可見，觀察組總有效（顯效+有效）率為91.11%，對照組總有效率為73.33%，觀察組高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

ROU是口腔黏膜疾病中發病率最高的一種疾病，具有周期性、復發性及自限性，發病時影響患者的生活及工作[7]。有研究提示，ROU的發生、發展與口腔微生態變化有關[8-9]。臨床上使用康復新液治療ROU的研究報道很多，可促進肉芽組織生長、抗炎、消除炎性水腫、提高機體免疫功能，療效明顯[10]。正常人體的口腔、腸道、呼吸道、泌尿生殖道等均定植一定數量的細菌，它們與宿主在長期進化過程中形成了一個能獨立進行物質、能量交流的動態平衡的生態系統。正常菌群對宿主起著有益和有害的雙重作用。口腔中的細菌在正常情況下對宿主有多種有益的生理作用，如抵抗外來致病菌、產生多種營養物質、促進免疫應答、產生過氧化物歧化酶及抗腫瘤等作用。而當微生態平衡遭到破壞，發生菌群失調，上述生理作用發生改變，它們對宿主就可造成傷害[11]。

本研究從口腔微生態的角度探討康復新液治療ROU的作用機制。結果顯示，治療前，所有ROU患者口腔中鏈球菌和韋榮菌的含量均低于正常組；經康復新液聯合干擾素-α2b治療后，觀察組口腔鏈球菌和韋榮菌的含量均較治療前明顯提高，這提示康復新液治療復發性口腔潰瘍的機制與口腔中鏈球菌及韋榮菌含量的增加有關；而僅予干擾素-α2b治療后，對照組患者口腔鏈球菌和韋榮菌的含量均較治療前明顯提高，但低于正常組和觀察組。這表明康復新液聯合干擾素-α2b治療能明顯改善ROU患者口腔鏈球菌和韋榮菌的含量。治療前后組間、組內奈瑟菌含量比較均無統計學差異，這提示康復新液治療ROU的作用機制可能與奈瑟菌無關。

有研究發現，ROU患者潰瘍期局部及外周血中淋巴細胞亞群呈現不平衡現象，ROU的發病可能是由于T細胞介導的免疫反應引起的口腔上皮細胞的損壞[12]。另有學者發現外周血CD4+、CD25+T細胞的數量在ROU的緩解期和發病期都低于正常人[13]。CD4+、CD25+T細胞不僅存在于胸腺，同進也存在于周邊組織。功能性T細胞抗原的特異性在阻止自身特異性疾病上具有重要性，故器官特異性T細胞的減少可能是潰瘍發生的關鍵[14-15]。鑒于此，本研究從T細胞亞群的角度探討康復新液治療ROU的作用機制，檢測患者治療前后CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例的變化。結果顯示，治療前，所有ROU患者外周血CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例均明顯低于正常組。經康復新液聯合干擾素-α2b治療后，觀察組患者CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例均較治療前明顯提高，這提示康復新液治療ROU的作用機制與改善T細胞亞群的比例有關；而僅予干擾素-α2b治療后，對照組患者CD4+、CD25+、Foxp3+T細胞比例也均較治療前明顯提高，但低于正常組和觀察組。這表明康復新液聯合干擾素-α2b治療能明顯提高ROU患者T細胞亞群的比例。同時本研究還發現觀察組療效優于對照組，即對于ROU，康復新液聯合干擾素-α2b的療效優于僅干擾素-α2b的療效。

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Kangfuxin liquid in treatment of recurrent oral ulcers

ZHANG Cunbao,SUN Li,ZHANG Xiong,et al.Department of Stomatology，the First People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310006,China

【 Abstract】 Objective To assess the efficacy of Kangfuxin liquid in treatment of recurrent oral ulcers(ROU)and related mechanism. Methods Ninety patients with ROU treated in our hospital from May 2010 to March 2014 were included in the study.Patients were randomly divided into two groups:45 cases in kangfuxin group were treated with Kangfuxin liquid and interferon-α2b and 45 cases in control group were treated with interferon-α2b alone.The efficacy rate of two groups was evaluated after treatment.The streptococcus sp.,Verllonella sp.and Neisseria sp.in oral samples were detected by RT-PCR and the levels of CD4+,CD25+,Foxp3+T in peripheral blood of two groups were measured by flow cytometry before and after treatment. Results Before treatment,the contents of streptococcus sp.and Verllonella sp.and the levels of CD4+,CD25+,Foxp3+in two groups were significantly lower than those in normal group(P＜0.05),while those indicators were increased after treatment(P＜0.05). However,all of these indicators in control group were still lower than those in Kangfuxin group and normal group(P＜0.05),while there was no significant difference between Kangfuxin group and normal group(P＞0.05).The overall effective rate in Kangfuxin group was higher than that in control group(91.11%vs 73.33%,P＜0.05). Conclusion Kangfuxin liquid is effective in treatment of recurrent oral ulcer,which is associated with the increased levels of streptococcus sp.and Verllonella sp.in oral cavity and the improved lymphocyte subsets in peripheral blood of patients.

KangFuXin Recurrent oralulcer Streptococcus sp.Verllonella sp.T-lymphocyte subsets

2015-05-21）

（本文編輯：李媚）

杭州市醫藥衛生科技計劃項目（2013A08）

310006 杭州市第一人民醫院口腔科（張存寶、孫莉、張雄、王永武、高莉萍），檢驗科（方翔）

高莉萍，E-mail：hzsy_glp@163.com