miR-128抑制結腸癌侵襲轉移的機制研究

曹躍鵬 龐洪雙 陳成 袁旦平

miR-128抑制結腸癌侵襲轉移的機制研究

曹躍鵬 龐洪雙 陳成 袁旦平

目的 分析miR-128在結腸癌細胞中的表達情況，研究其對結腸癌細胞生物學行為的影響及作用機制。方法 對轉染miR-128模擬物后的結腸癌SW48細胞進行培養，采用MTT法行細胞增殖實驗檢測細胞增殖能力，細胞劃痕法檢測細胞遷移能力，Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力；并采用RT-RCR檢測miR-128 mRNA的表達，Western blot法檢測miR-128蛋白的表達。結果 轉染miR-128模擬物后的結腸癌SW48細胞較轉染空白對照模擬物后的，細胞增殖、侵襲及遷移能力均下降（均P＜0.05），且轉錄因子Sp1基因在mRNA及蛋白水平均下降（均P＜0.05）。結論 miR-128可抑制結腸癌細胞增殖及侵襲轉移，可能通過調控Sp1基因發揮上述作用。

miR-128 結腸癌 侵襲轉移 增殖

結腸癌是全球發病率及病死率較高的惡性腫瘤[1]，主要行手術治療、化療及放療。結腸癌侵襲轉移是疾病治療失敗的主要原因。其侵襲轉移的機制包括上皮間質轉化、細胞外基質降解、血管生成及微環境改變等[2]。癌基因及抑癌基因的轉錄調控失衡是結腸癌侵襲轉移的另一重要原因。miRNA是長度約為19～24個堿基的非編碼RNA，主要通過結合靶基因mRNA的3′端非編碼區，降解mRNA或抑制其翻譯，調控靶基因的表達，進而影響細胞增殖、轉移等[3]。已有研究表明，miR-128對前列腺癌及腦膠質瘤的侵襲轉移有明顯的抑制作用[4-5]。本研究通過分析miR-128在結腸癌細胞中的表達情況及對其生物學功能的影響，探討miR-128與結腸癌增殖及侵襲轉移的關系，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人結腸癌SW48細胞由寧波市第一醫院中心實驗室保存。DMEM高糖培養基和FBS為美國Gibco公司產品，Sp1及GAPDH抗體為Santa Cruz公司產品，Matrigel膠為美國BD公司產品，Lipofectamin 2000為美國Invitrogen公司產品，MTT試劑為上海碧云天生物公司產品，Transwell小室為美國康寧公司產品，Trizol試劑盒為上海英俊公司產品，RT-PCR逆轉錄試劑盒為美國Fermentas公司產品。miR-128模擬物及空白對照模擬物為廣州銳博公司產品。GAPDH、Sp1、U6、miR-128引物為上海英俊公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將結腸癌SW48細胞傳代至6孔板、24孔板或96孔板，待細胞融合度達50%～80%時使用miR-128模擬物及空白對照模擬物轉染；培養6h后換液，48h后收集細胞進行以下實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗 采用MTT法行細胞增殖實驗。利用胰酶消化結腸癌SW48細胞，細胞計數，按1 000個細胞/孔濃度接種于96孔板中；每隔2 h，每孔加入20μl MTT試劑，37℃繼續培養4h；酶標儀測定波長為490nm的吸光度值，分別記錄0、24、48、72、96h的吸光度值，以吸光度值代表細胞增殖能力，重復實驗3次。

1.2.3 細胞遷移實驗 使用細胞劃痕法檢測細胞遷移能力。將結腸癌SW48細胞接種于6孔板，至生長至100%融合度；使用無菌10μl槍頭在細胞板上劃痕，洗滌細胞；加入5%血清的培養基培養，24h后觀察細胞的變化并攝像；分別測量轉染miR-128模擬物及轉染空白對照的細胞任意3個部位的不同寬度，計算傷口愈合率，取平均值代表細胞遷移能力，重復實驗3次。

1.2.4 細胞侵襲實驗 采用Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞侵襲能力。取25μl 50%的Matrigel膠加入Transwell小室中，在37℃培養箱中孵育2h；用胰酶消化貼壁結腸癌SW48細胞，稀釋至2.5×105個/ml；吸取200μl細胞懸液和800μl含20%血清的培養基加入Transwell板的上室中，放回細胞培養箱；培養48h后，應用1%的甲醛固定后使用0.1%結晶紫染色，于顯微鏡下選取3個視野觀察并計數，取平均值代表細胞侵襲能力，重復實驗3次。

1.2.5 RT-PCR檢測miR-128 mRNA的表達 按照Trizol試劑盒使用說明書從結腸癌SW48細胞中提取RNA；按照RT-PCR逆轉錄試劑盒說明書將mRNA反轉錄為cDNA，使用GAPDH、Sp1、U6、miR-128引物進行RT-PCR擴增，引物序列見表1；以GAPDH或U6基因表達為內參，以Ct值代表結腸癌SW48細胞中miR-128及Sp1基因mRNA的表達水平，重復實驗3次。

表1 GAPDH、Sp1、U6、miR-128引物序列

1.2.6 Western blot法檢測miR-128蛋白的表達 使用NP40裂解液提取結腸癌SW48細胞的總蛋白，上樣量為50μg；采用SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h；分別用GAPDH、Sp1抗體4℃孵育過夜，次日孵育對應的二抗，室溫孵育1h，使用Tris-HCl緩沖鹽溶液洗滌后ECL化學顯色；重復實驗3次。

1.2.7 miR-128靶基因預測 采用生物信息學的方法，應用Traget Scan等數據庫對miR-128靶基因進行預測；進而用RT-PCR及Western Blot法檢測miR-128對靶基因表達的影響，以驗證靶基因。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 轉染miR-128模擬物后結腸癌SW48細胞增殖實驗吸光度值的變化 見表2。

表2 轉染miR-128模擬物后結腸癌SW48細胞增殖實驗吸光度值的變化

由表2可見，轉染miR-128模擬物后的結腸癌SW48細胞較轉染空白對照模擬物的，增殖能力下降（P＜0.05）。

2.2 轉染miR-128模擬物后結腸癌SW48細胞遷移實驗傷口愈合率、侵襲實驗視野細胞數的變化 見表3。

表3 轉染miR-128模擬物后結腸癌SW48細胞遷移實驗傷口愈合率、侵襲實驗視野細胞數的變化

由表3可見，轉染miR-128模擬物后的結腸癌SW48細胞較轉染空白對照模擬物的，遷移、侵襲能力均下降（均P＜0.05）。

2.3 miR-128靶基因 miR-128可以影響轉錄因子Sp1基因的表達（圖1a），轉染miR-128模擬物后的結腸癌SW48細胞較轉染空白對照模擬物的，Sp1基因在mRNA及蛋白水平均下降（圖1b、c，均P＜0.05）。

圖1 miR-128靶基因預測（a：可能靶基因Sp1；b：Western blot電泳圖；c：PT-RCR結果）

3 討論

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，且其發病率和病死率仍在不斷上升，嚴重威脅人類健康。結腸癌發生侵襲轉移是導致治療效果不佳的重要原因。大多學者認為其侵襲轉移是由多種癌基因及抑癌基因的表達異常導致的[6-7]。

多種腫瘤中miRNA存在異常表達。現已發現miR-128可通過抑制BMI-1基因表達來抑制前列腺癌的進展[5]。Donzelli等[8]發現miR-128通過靶向調控E2F5基因增強突變型p53的功能，從而影響肺癌的進展。本研究通過轉染miR-128模擬物使得結腸癌細胞過表達miR-128，進而行結腸癌細胞生物學行為相關實驗。結果發現，過表達miR-128的結腸癌細胞增殖能力降低。這說明miR-128可抑制結腸癌細胞的增殖。此外，本研究還發現miR-128能明顯抑制結腸癌細胞的遷移、侵襲能力。由此可知，miR-128在結腸癌侵襲轉移中發揮重要作用。

目前，miRNA的研究多采用生物信息學的方法來預測下游可能的靶基因[9]。本研究通過Target Scan網站篩選了miR-128可能的靶基因。通過RT-PCR及Western blot法發現，當miR-128過表達后，轉錄因子Sp1基因在mRNA及蛋白水平均下降。Sp1蛋白屬于Sp/類Krǜppel轉錄因子家族，已有研究表明，Sp1可以通過調控癌基因、抑癌基因、細胞周期調控分子以及生長相關信號轉導通路，對各型腫瘤細胞產生重要影響[10]。

綜上所述，miR-128可通過抑制結腸癌細胞的增殖，進而抑制其侵襲轉移的能力，其可能是通過抑制Sp1基因的表達來發揮作用。

[1] Hansen TF,Sorensen F B,Lindebjerg J,et al.The predictive value ofmicroRNA-126 in relation to firstline treatmentwith capecitabine and oxaliplatin in patients with metastatic colorectal cancer[J].BMC cancer,2012,12(1):83.

[2] GulhatiP,Bowen KA,Liu J,et al.mTORC1 and mTORC2 regulate EMT,motility,and metastasis of colorectal cancer via RhoA and Rac1 signaling pathways[J].Cancer research,2011,71(9):3246-3256.

[3] Shang J,Fu Y,Wang Y,et al.MicroRNA-23a Antisense Enhances 5-Fluorouracil Chemosensitivity Through APAF-1/Caspase-9 Apoptotic Pathway in ColorectalCancer Cells[J].Journalof Cellular Biochemistry,2014,115(4):772-784.

[4] Dong Q,CaiN,Tao T,et al.An Axis Involving SNAI1,microRNA-128 and SP1 Modulates Glioma Progression[J].PloS one,2014, 9(6):e98651.

[5] Min J,Tao Z,Can L,et al.miRNA-128 suppresses prostate cancer by inhibiting BMI-1 to inhibit tumor-initiating cells[J].Cancer Research,2014,74(15):4183-4195.

[6] 陳建武,王佩飛,鄭佩贊,等.結腸癌中COX-2表達及其與腫瘤脈管生成的關系[J].浙江醫學,2012,34(20):1644-1646.

[7] 余紅敏,陳積賢,任約翰,等.miR-142-3p在結直腸癌中的表達及其臨床意義[J].浙江醫學,2013,35(17):1565-1567.

[8] Donzelli S,Fontemaggi G,Fazi F,et al.MicroRNA-128-2 targets the transcriptional repressor E2F5 enhancing mutant p53 gain of function[J].CellDeath&Differentiation,2011,19(6):1038-1048.

[9] 李楠.miR-126靶向調控IRS1,SLC7A5及TOM1基因抑制結腸癌的增殖及侵襲轉移[J].中南大學學報(醫學版),2013,38(8):809-817.

[10] Ivanovska I,BallAS,Diaz R L,et al.MicroRNAs in the miR-106b family regulate p21/CDKN1A and promote cell cycle progression[J].Molecular and cellular biology,2008,28(7):2167-2174.

MicroRNA-128 inhibits invasion of colon cancer cells

CAO Yuepeng，PANG Hongshuang，CHEN Cheng,et al.Department of Anorectal Surgery，Ningbo First Hospital,Ningbo 315010,China

Objective To investigate the expression of microRNA-128(miR-128)in colon cancer cells and its effect on invasion and metastasis of cancer cells. Methods Human colon cancer SW48 cells were transfected with miR-128 mimics.The cell proliferation was determined by MTT assay,cell migration and invasion were detected by scratch and Transwell methods,the target genes of miR-128 were identified by Western Blot and qPCR methods. Results The proliferation,invasion and migration in miR-128-transfected SW48 cells(P＜0.05).The expression of Sp1 mRNA and protein level were decreased in miR-128 over-expressing SW48 cells(P＜0.05). Conclusion MicroRNA-128 can inhibit the proliferation and invasion of colon cancer,in which Sp1 gene may be involved.

miR-128 Colon cancerMetastasis Proliferation

2014-09-09）

（本文編輯：李媚）

寧波市科技計劃項目（201501HJ-B01430）

315000 寧波市第一醫院肛腸外科（曹躍鵬、龐紅雙、袁旦平）；山東大學齊魯醫院普外科（陳成）

袁旦平，E-mail：yuandanping1964@163.com