MT1-MMP在病毒性心肌炎小鼠中的表達及三七總皂甙的干預作用

榮星 吳婷婷 夏天和 吳蓉洲 陳其

MT1-MMP在病毒性心肌炎小鼠中的表達及三七總皂甙的干預作用

榮星 吳婷婷 夏天和 吳蓉洲 陳其

目的 觀察膜型基質金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）在病毒性心肌炎小鼠中的表達及意義。方法 選用近交系4～6周齡雄性BALB/C小鼠，采用隨機數(shù)字表法分為3組：空白對照組、心肌炎組、治療組。于病毒接種后第8、15、21天分別采血后處死小鼠并留取心臟標本。分別采用RT-PCR法及免疫組化法檢測心肌MT1-MMP的mRNA及蛋白表達，光鏡觀察心肌組織病理改變。結果 心肌炎組和治療組各時間點心肌細胞MT1-MMP的mRNA含量明顯高于空白對照組（P＜0.01），治療組在第15、21天明顯低于心肌炎組（P＜0.05或0.01）；心肌炎組和治療組各時間點心肌細胞MT1-MMP免疫組化染色呈強陽性表達，空白對照組呈弱陽性。與心肌炎組比較，治療組心肌細胞MT1-MMP表達在第15、21天降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。結論 MT1-MMP可能參與了病毒性心肌炎小鼠的發(fā)病，中藥三七總皂甙可能通過降低MT1-MMP的表達起治療作用。

病毒性心肌炎 膜型基質金屬蛋白酶-1 三七總皂甙 小鼠

病毒性心肌炎是兒童較常見的感染性心肌疾病之一，除暴發(fā)性心肌炎外大多預后較好，但治療不及時，仍有一部分可導致慢性心肌炎甚至擴張型心肌病，因此受到臨床重視。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類具有降解幾乎所有細胞外基質為主要功能的內源性蛋白水解酶，研究表明，MMP-2、MMP-9和MMP-12在病毒性心肌炎中表達明顯升高，推斷CVB3感染后細胞外基質（ECM）的重塑與MMPs表達和活性增強有關。膜型基質金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）的作用有別于其他MMPs，其可能促進心肌纖維化的形成[1]。本文旨在探討病毒性心肌炎小鼠使用三七總皂甙進行干預后心臟組織MT1-MMP表達含量的變化，探討MT1-MMP在病毒性心肌炎中可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗動物和方法

1.1 實驗動物及分組 近交系4～6周齡雄性Balb/c小鼠68只，購自于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK2003-0003。三七總皂甙（商品名：血塞通注射液，國藥準字號Z53020134）購于云南植物藥液有限公司。CVB3病毒Nancy標準株購自于山東省醫(yī)學科學院病毒室，在Hep-2細胞上傳代，凍融3次離心后留取上清液，測組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）為10-4.36。將小鼠按隨機數(shù)字表法分為3組，空白對照8只，心肌炎組30只，治療組30只。空白對照組于第0天每只小鼠腹腔注射不含病毒的1640培養(yǎng)液0.1ml，心肌炎組和治療組在第0天每只小鼠腹腔注射0.1ml 10-4.36TCID50/ml的CVB3復制心肌炎模型，然后心肌炎組分別腹腔注射0.1ml 0.9%氯化鈉溶液，1次/d，治療組按180mg/kg的劑量腹腔內注射三七總皂甙注射液，1次/d，于第8、15、21天心肌炎組及治療組小鼠分別按隨機數(shù)字表法抽取8只，空白對照組（8只）在第21天小鼠眼球取血后用頸椎脫臼的方法處死并留取心臟標本。

1.2 方法

1.2.1 心肌HE染色與炎癥積分 （1）HE標本制作及觀察：小鼠心臟取出后快速放入預冷的含4%多聚甲醛小瓶中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，厚約4μm，進行HE染色，光鏡下觀察心肌的病理變化。（2）炎癥積分參照Rezkalla方法計分[2]，即每張切片隨機取5個視野，計算每個視野區(qū)域炎癥細胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個視野的面積之比：無病變0分，≤25%計1分，≤50%計2分，≤75%計3分，＞75%計4分。

1.2.2 半定量RT-PCR檢測心肌MT1-MMP mRNA含量 取左心室心尖心肌組織在液氮環(huán)境下研成粉末，采用TRIZOL（美國Life公司）一步抽提法提取總RNA，逆轉錄反應體系25μl，含RNA 2μg，隨機引物1μl，DEPC 5μl，RNA酶抑制劑0.5μl，10mmol/L dNTPs 1.25μl，MMLV200 U（1μl），5×反應緩沖液5μl，37℃反應60min，將RNA逆轉錄為cDNA。PCR擴增反應體系20μl含：cDNA2μl，10mmol/LdNTPs 0.5μl，Taq 1μl（3U），10×反應緩沖液2μl，25mmol/L MgCl 2 1.2μl，MT1-MMP上下游引物各1μl（20pmol）。每一PCR循環(huán)包括95℃變性1min，60℃退火45s，72℃延伸1.5min，30個循環(huán)后繼續(xù)72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（180V）后，銀染，用ImagemasterVDS成像系統(tǒng)攝影存盤后，應用計算機圖像分析軟件（TolallabV101）行光密度值掃描分析，得到mRNA表達量的相對含量。MT1-MMP引物序列：上游引物5′ATC TGT GAC GGG AAC TTT GAC-3′下游引物5′ACC TTC AGC TTC TGG TTG TTG-3′，產(chǎn)物長度為526bp。

1.2.3 心肌中MT1-MMP蛋白免疫組化檢測 MT1-MMP免疫組化一抗（編號BA1278）、即用型SABC過氧化物酶試劑盒（含二抗）（編號SA1020）均購自武漢博士德生物工程有限公司。操作步驟按說明書進行，最后使用藍色DAB顯色，核固紅復染，陽性結果顯示藍黑色。圖像分析使用美國IPP5.0（Image Pro-plus 5.0）專業(yè)圖像分析軟件測定平均吸光度值，代表MT1-MMP蛋白表達的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性者兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊者進行Dunnet's T3檢驗。相關分析采用Pearson相關分析法并建立直線回歸方程。

2 結果

2.1 小鼠不同時點心肌病理變化及炎癥積分比較見圖1、表1。

圖1 心肌細胞HE染色（C：對照組小鼠心肌未見炎癥細胞浸潤；V：心肌炎組15d見心肌細胞見大量炎癥細胞浸潤；T：治療組15d見少量炎癥細胞浸潤；HE染色，×200）

由圖1可見，心肌炎組和治療組感染CVB3后的第8天，心室內可見大面積心肌細胞壞死崩解，周圍出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，壞死灶內可見藍色鈣化顆粒，部分心肌細胞胞質染色嗜酸性增強、均質化，胞核和細胞輪廓消失。第15、21天，心肌炎癥細胞浸潤面積逐漸減小。空白對照組心肌細胞正常。小鼠感染病毒后第8天開始出現(xiàn)死亡，至第21天心肌炎組死亡9只（30.0%），治療組死亡5只（16.7%），空白對照組無死亡。

表1 小鼠不同時點炎癥積分比較

由表1可見,治療組炎癥積分在第15天及第21天低于心肌炎組（P＜0.05或0.01）。

2.2 各組小鼠不同時點MT1-MMP mRNA比較 見圖2、表2。

圖2 心肌MTl-MMP mRNA的RT-PCR產(chǎn)物電泳結果（C：對照組；T8：T組第8天；T15：T組第15天；T21：T組第21天；V8：V組第8天；V15：V組第8天；V21：V組第21天）

表2 各組小鼠不同時點MT1-MMP mRNA光密度值比較

由圖2、表2可見，心肌炎組和治療組各時點心肌細胞MT1-MMP的mRNA含量均高于空白對照組（均P＜0.01)，治療組在第15天及21天均低于心肌炎組（P＜0.05或0.01）。心肌炎組和治療組心肌細胞MT1-MMP的mRNA含量在第15天達到高峰，第21天有所下降，但仍高于第8天（均P＜0.01）。

2.3 心肌中MT1-MMP蛋白免疫組化結果 見圖3、表3。

圖3 心肌MTl-MMP免疫組化結果（C：對照組小鼠心肌MT1-MMP染色弱陽性；V：心肌炎組15d見心肌細胞MT1-MMP染色強陽性；T：治療組15d心肌細胞MT1-MMP染色強陽性；免疫組化染色，×200）。

表3 MT1-MMP免疫組化平均吸光度值比較

由圖3、表3可見，心肌炎組和治療組各時間點MT1-MMP免疫組化染色均成強陽性表達，治療組在第15天及21天MT1-MMP吸光度低于心肌炎組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01），空白對照組心肌MT1-MMP免疫組化染色呈弱陽性。

2.4 MT1-MMP的mRNA與蛋白表達的相關性分析 MT1-MMP的mRNA與蛋白表達呈明顯正相關（r＝0.823，P＜0.01），詳見圖4。

3 討論

根據(jù)MMPs的結構特點可分為兩種類型：分泌型MMPs及膜結合型MMPs。現(xiàn)在已知的MMPs大多屬于分泌型MMPs，而膜結合型MMPs可以不受內源性金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）的影響。MT1-MMP即MMP14是1994年由Sato等[3]首先從人胚胎cDNA文庫中篩選出的一條新基因，約3.5kb，編碼含582個氨基酸的蛋白質，分子量約66kDa。既往的研究表明，MT1-MMP具有降解細胞外基質、水解活性小分子物質如細胞因子、激活其他MMPs如MMP-2等作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MTl-MMP在心肌梗死小鼠心肌中可激活纖維化信號，參與了心肌重塑[1，4]。Kim等[5]的研究也發(fā)現(xiàn)，機械刺激血管內皮細胞及成纖維細胞后MTl-MMP的表達明顯增加。Zile等[6]通過結扎小鼠主動脈增加左心室壓力負荷，發(fā)現(xiàn)，MT1-MMP的表達及活性在第1周明顯增加，第2周下降，至第4周又明顯增加，且與膠原容積片段呈明顯正相關，表明MT1-MMP參與了壓力負荷誘導的基質重塑及纖維化。

圖4 MT1-MMP的mRNA與蛋白表達的相關性分析

在病毒性心肌炎的研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-2通過裂解趨化因子MCP-3在病毒性心肌炎中發(fā)揮抗炎作用，在病毒性心肌炎小鼠敲除MMP-2基因后，心肌細胞的凋亡、重塑，病毒侵襲及心功能均較對照組惡化。此外在心力衰竭的研究中也發(fā)現(xiàn)，MMP-9在慢性心力衰竭患者進行心臟再同步化治療后明顯下降，可作為治療效果評價的標志物[7]。MT1-MMP在病毒性心肌炎中的表達如何，目前報道較少。我們的研究表明，病毒性心肌炎中MT1-MMP的mRNA及蛋白表達與對照組相比均明顯升高，且各時間點MT1-MMP的mRNA與蛋白表達呈明顯的正相關，因此推測，MT1-MMP可能參與了病毒性心肌炎的發(fā)病。病毒性心肌炎所致的心肌局部缺血及心功能不全所致心臟容量負荷增加均可能誘導了MT1-MMP含量的增加。MT1-MMP含量的增加不僅通過激活MMP-2等基質金屬蛋白酶破壞心肌間質，而且可能通過促進轉化生長因子TGF-β的釋放及膠原纖維的合成參與了病毒性心肌炎的病理生理過程，從而參與了慢性病毒性心肌炎所導致的擴張性心肌病及心室重構。有關MT1-MMP在病毒性心肌炎中的具體作用機制還有待實驗進一步驗證。

中藥三七總皂甙具有抗炎，增強機體免疫力等作用。研究表明三七總皂苷可以抑制肝纖維化大鼠MMP-13、TIMP-1表達，從而對大鼠肝纖維化具有一定的保護作用[8]。另外在大鼠心肌梗死后心室重構的研究中也發(fā)現(xiàn)，三七總皂甙能夠抑制TNF-α與MMP-2的分泌與釋放，從而減輕大鼠的心肌缺血再灌注損傷[9]。我們的研究表明，三七總皂甙在病毒接種后的第15天及第21天可以降低病毒性心肌炎小鼠MTl-MMP的表達，而在第8天降低不明顯，推測三七總皂甙可能通過抑制MT1-MMP的表達，在減輕心肌炎癥及纖維化中可能發(fā)揮一定的作用。

[1] Dixon J A,Gaillard W F,Rivers W T,et al.Heterogeneity in MT1-MMP activity with ischemia-reperfusion and previous myocardial infarction:relation to regional myocardial function[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,299(6):H1947-1958.

[2] Rezkalla S,Kloner R A,Khatib G,et al.Effect of metoprolol in acute Coxsackievirus B3 myocarditis[J].J Am Coll Cardiol,1988, 12(8):412-414.

[3] Sato H,Takino T,Okada Y,et al.Amatrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumour cells[J].Nature,1994, 370(6484):61-65.

[4] Spinale F G,Escobar G P,Mukherjee R,et al.Cardiac-restricted overexpression of membrane type-1 matrix metalloproteinase in mice:effects on myocardialremodeling with aging[J].Circ Heart Fail,2009,2(4):351-360.

[5] Kim J I,Cordova AC,Hirayama Y,et al.Differentialeffects ofshear stress and cyclic strain on Sp1 phosphorylation by protein kinase Czeta modulates membrane type 1-matrix metalloproteinase in endothelialcells[J].Endothelium,2008,15(1):33-42.

[6] Zile M R,Baicu C F,Stroud R E,et al.Pressure overloaddependent membrane type 1-matrix metalloproteinase induction: relationship to LV remodeling and fibrosis[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2012,302(7):H1429-1437.

[7] 王亞利,唐禮江,劉元偉,等.血清NT-pro-BNP和MMP-9水平變化評價慢性心力衰竭患者心臟再同步化治療療效的可行性研究[J].浙江醫(yī)學,2014,36(10):850-853.

[8] 姜輝,夏倫祝,李穎,等.三七總皂苷對肝纖維化大鼠基質金屬蛋白酶-13及其抑制因子-1表達的影響[J].中國中藥雜志,2013,38(8): 1206-1210.

[9] 郭潔文,鄧志軍,符永恒,等.三七總皂苷對心梗后心室重構大鼠腫瘤壞死因子-α與基質金屬蛋白酶表達的影響及其作用機制[J].南方醫(yī)科大學學報,2009,29(10):2048-2050.

Expressions of MT1-MMP in myocardium of mice with viral myocarditis

RONG Xing,WU Tingting,XIA Tianhe,et al.Children Heart Center of Yuying Pediatrics Hospital,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Objective To investigate the expression of membrane type 1 matrix metalloproteinase(MT1-MMP)in myocardium of mice with viral myocarditis,and the effect of panax notoginsenosides(PNS)on MT1-MMP. Methods Sixty eight inbred male Balb/C mice of 4～6 weeks were divided randomly into 3 groups:the mice in blank group(group C)were inoculated intraperitoneally(i.p.)with free virus 1640 culture solution 0.1ml on day 0,the mice in VMC group (group V)were inoculated i.p. with 0.1ml Tissue Culture Infectious Dose 50 (TCID50)of 10-4.36/ml Coxsackie viruses B3 (CVB3)on day 0,the mice in treatment group(group T)were inoculated i.p with Coxsackie viruses B3 and PNS 180mg/kg.The animals were sacrificed on d8,d15,and d21 after infections.The hearts tissue slides were HE stained for histological changes;and immunohistochemically (IHC)stained for MT1-MMP protein expression.The MT1-MMP mRNA expression was detected by RT-PCR method. Results The expressions of MT1-MMP mRNA in groups V and T were higher than group C in all time points(P＜0.01);the expression was lower in group T than that in group Vat d15 and d21(P＜0.05 or 0.01).The IHC staining showed that myocardial cells had strong expression of MT1-MMP in groups V and T and mild expression in the group C.Compared with group V,the IHC OD values of group T was significantly lower at d15 and d21(P＜0.05 or 0.01). Conclusion MT1-MMP may be involved in the pathogenesis of viral myocarditis in mice.Traditional Chinese medicine PNS may have some therapeutic effect by reducing the expression of MT1-MMP.

Viral myocarditis Membrane type 1 matrix metalloproteinase Panax notoginsenosides Mice

2015-05-01）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省自然基金（Y2100670）

325027 溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院兒童心臟中心

吳蓉洲，E-mail:wrz71@hotmail.com