銀杏葉提取物對家兔凝血功能的影響研究

唐志苗 倪一鳴

銀杏葉提取物對家兔凝血功能的影響研究

唐志苗 倪一鳴

目的 通過觀察銀杏葉提取物（Egb761）注射液對家兔血小板計數(shù)（PLT）、血漿凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、血小板第3因子（PF3aT）的作用，從而探討Egb761對家兔凝血功能的影響。方法 24只家兔隨機分成對照組（耳緣靜脈注射0.9%氯化鈉注射液0.3ml/kg），小劑量組（耳緣靜脈注射Egb761 0.3ml/kg），中劑量組（耳緣靜脈注射Egb761 1.5ml/kg），大劑量組（耳緣靜脈注射Egb761 3.0ml/kg），每組6只（雌雄對半），連續(xù)給藥1周（7d），于給藥的第7天靜脈注射Egb761后1.5h自耳緣動脈采血5ml，檢測PLT、PT、APTT、PF3aT等指標(biāo)。結(jié)果 Egb761對正常家兔的PT、APTT、PLT均無影響（均P＞0.05），但影響PF3aT，使用PF3aT的第3管較第4管延長（P＜0.05）。結(jié)論 Egb761通過影響血小板活化，進而影響PF3aT，導(dǎo)致機體凝血功能缺陷，使機體處于易出血狀態(tài)，從而可能影響家兔的抗凝治療。

銀杏葉提取物注射液 家兔 凝血功能

從銀杏葉中提取出有藥用成分的化合物主要為黃酮類及銀杏內(nèi)脂等，簡稱為銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，Egb761），在臨床上已廣泛應(yīng)用。但有報道Egb761本身或與華法林聯(lián)用有增加出血的危險[1],但其具體機制尚不明確。本文通過動物實驗的方法，觀察Egb761對血小板計數(shù)（PLT）、血漿凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、血小板第3因子（PF3aT）有效性試驗的影響，報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔，雌雄各半，體重1.9～2.1（2.16±0.13）kg，購于金華市藥檢所，合格證號：SYCXK（浙）2006-0024。

1.2 藥物、試劑和儀器 Egb761注射液（金納多）為5ml/支,含Egb761 17.5mg，其中含銀杏黃酮4.2mg，德國威碼舒培博士藥廠生產(chǎn)；華法林鈉片：3.0mg/片，芬蘭Orion Corporation公司提供；PT試劑（意大利IL公司生產(chǎn)）；APTT試劑（意大利IL公司生產(chǎn)）；40g/L白陶土懸液（以9g/L氯化鈉作為溶劑）；0.025mol/L氯化鈣溶液。XE-2100全自動血液分析儀（日本SYSMEX公司產(chǎn)品）及原裝配套試劑；廣州陽普醫(yī)療用品有限公司提供的血凝試管（109mmol/L檸檬酸鈉1∶9）；AL-9000全自動血凝分析儀（意大利IL公司產(chǎn)品）；水浴恒溫箱；秒表。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及干預(yù)措施 新西蘭大白兔24只，由專業(yè)飼養(yǎng)人員同一批全價營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)，并保持飼養(yǎng)及實驗場所溫度17～25℃，相對濕度40%～70%。隨機分為4組，分別為對照組及Egb761大、中、小劑量組，每組各6只，雌雄各半。各組動物先耳緣靜脈注射給藥，Egb761小、中、大劑量組分別注射Egb761注射液（0.3、1.5、3.0ml/kg，約相當(dāng)于人的劑量1、5、10倍）；對照組注射0.9%氯化鈉注射液（0.3ml/kg），連續(xù)給藥1周（7d），于給藥的第7天靜脈注射Egb761后1.5h自耳緣動脈采血5ml，檢測PLT、PT、APTT、PF3aT等指標(biāo)。

1.3.2 標(biāo)本的處理和監(jiān)測 用真空采集法從兔耳緣動脈直接采血至專用血凝試管，血常規(guī)試管各1份；PT、APTT按操作規(guī)程在AL-9000全自動血凝分析儀上檢測；PLT按操作規(guī)程在XE-2100全自動血液分析儀上檢測；PE3aT有效性測定，嚴(yán)格按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行[2]。

1.3.2.1 富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP）的制備 自清醒新西蘭大白兔耳緣動脈真空取血，以109mmol/L檸檬酸鈉1∶9抗凝收集于血凝試管中的血，于室溫經(jīng)1 800r/min離心10min，所得血漿即為PRP；剩余血液再以4 000r/min離心10min，上層液即為PPP作為測定時調(diào)零或用于調(diào)整PRP中的PLT及實驗過程中，PRP中的PLT調(diào)整至約500×109/L。

1.3.2.2 PF3aT測定注意事項 真空采血順利并立即分離血漿；PRP中PLT調(diào)至（540±20）×109/L，PPP中PLT調(diào)至（10～20）×109/L，避免紅細(xì)胞混入；標(biāo)本測定前所用的器材均為凝血專用器材，測定時的試管用潔凈玻璃試管；40g/L白陶土懸液使用前充分混勻，白陶土加入標(biāo)本后，標(biāo)本在孵育期也混勻數(shù)次；每組測定2次，取平均值。

1.3.2.3 PF3aT測定步驟 取4支小試管分4組，按表1每管加入PRP和PPP各0.1ml。將上述4支試管置37℃水浴預(yù)溫2min后從第1管起依次每隔2min加0.2ml白陶土懸液；記錄加入白陶土的時間，20min后一次加入0.2ml濃度為0.025mmol/L的氯化鈣溶液，同時啟動秒表測定凝固時間。

表1 PF3aT測定的試管分組

1.3.2.4 PF3aT測定結(jié)果判斷 第3組、第4組分別為待測者和正常對照管，第1組較第2組凝固時間延長5s以上為異常，見于PF3aT減低；PF3aT有缺陷或內(nèi)源凝血因子有缺陷時第3組凝固時間比第4組長。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

本組實驗中未發(fā)現(xiàn)所實驗家兔有明顯出血癥狀。

2.1 各組兔靜脈注射Egb761后PT、APTT及PLT變化比較 見表2。

表2 兔靜脈注射Egb761后PT、APTT及PLT變化

由表2可見，各組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2各組兔靜脈注射Egb761后PF3aT值變化比較 見表3。

表3 兔靜脈注射Egb761后PF3aT值變化

由表3可見小、中、大劑量組第1管凝固時間與第2管比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而第3管凝固時間比第4管顯著延長（P＜0.01），但不同組間凝固時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 兔靜脈注射Egb761后對PF3aT的值不同管間差值比較 見表4。

表4 兔靜脈注射Egb761后PF3aT不同管間差值比較

由表4可見，兩組第1管與第2管差值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組第3管與第4管差值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

銀杏葉作為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的藥用植物，治療哮喘和和支氣管炎，已有悠久的歷史。而今，其通過現(xiàn)代加工技術(shù)將銀杏葉有效成分加以分離、富集而獲得的標(biāo)準(zhǔn)制劑，稱之為Egb761（其中含有24%的黃酮，6%萜內(nèi)酯類，另70%由酚類、氨基酸等組成），廣泛應(yīng)用于臨床。十余年來，大量的研究表明，Egb761首先可以作為一種天然的還原劑，用以清除機體內(nèi)過多的自由基。如銀杏黃酮可以清除O2、OH、NO等自由基，銀杏苦內(nèi)酯A則可以減少自由基的形成，從而抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，防止自由基對機體造成的一系列傷害。此外Egb761尚可以降低全血黏稠度，改善血液流變學(xué)指標(biāo)[3]；調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)，維持動靜脈張力等作用。因此Egb761已廣泛應(yīng)用于臨床各科，尤其是用于治療腦部血液循環(huán)障礙所致疾患[4]，如中風(fēng)、記憶力減退、癡呆等。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，Egb761同樣可以用于保護心肌缺血再灌注損傷[5]；預(yù)防心肌缺血再灌注后心率失常的發(fā)生[6]。已有學(xué)者將Egb761用于心臟外科的臨床治療，對體外循環(huán)后心臟功能的恢復(fù)起到了積極的作用。

但近年來不斷有Egb761引起出血的報道[7]。并建議患有心臟病、腦梗死、各種血栓癥并且在服用華法林等抗凝藥物的時候，應(yīng)盡量避免同時使用Egb761[8]。Egb761本身或與華法林聯(lián)用有增加出血的危險，但其具體機制尚不清楚；Egb761是否會使機體處于易出血狀態(tài)，引起出血并發(fā)癥，也尚存在爭議[9]。這使得我們在臨床工作中，對于是否將Egb761用于換瓣術(shù)前、術(shù)后的輔助治療，一直心存顧慮。因此，我們試圖用動物實驗的方法，觀察Egb761對凝血功能有無影響。

本研究結(jié)果表明，Egb761對兔凝血功能有影響。文中表2提示大、中、小劑量Egb761均對PLT、PT、APTT均無影響，這與文獻報道相吻合[10]。但表3、4提示Egb761對PF3aT有影響，第3管值大于第4管（正常值），但不同劑量Egb761對PF3aT作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示Egb761能使機體處于凝血功能缺陷狀態(tài)，機體容易出血。

凝血因子相互作用需要磷脂表面。磷脂表面來自PF3，也來自組織因子（TF）。沒有PF3aT和TF這兩個磷脂表面，凝血過程就無法進行。PF3aT是在血小板活化過程中的產(chǎn)物，為凝血因子提供活化所需的磷脂表面[11]，而Egb761中銀杏內(nèi)酯是血小板活化因子（PAF）的拮抗劑[12]，故Egb761可通過影響血小板功能活化而使PF3aT減少，進而使為凝血提供催化所需的磷脂表面的有效面積減少，吸附并激活的凝血因子（Ⅱ、Ⅹ）也相應(yīng)減少。另外，血小板內(nèi)容物中包含有種類較多的凝血因子也在活化時一同釋放出來,這樣Egb761通過影響血小板功能活化最終使血液凝固減慢，導(dǎo)致凝血功能缺陷，使機體處于易出血狀態(tài)。表現(xiàn)為對PF3aT有影響，即第3管值大于第4管（正常值）。這與沈連忠等[13]報道相符。由于Egb761只影響血小板活化，故對PLT、PT、APTT無影響。

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Effect of Ginkgo bibola leave extract on coagulation function of rabbits

TANG Zhimiao,NI Yiming.Department of Thoracic Surgery, Jinhua Municipal Hospital,Jinhua 321000,China

Objective To investigate the effect of extract of Ginkgo bibola leaves(Egb)on coagulation function of rabbits. Methods Twenty four rabbits were randomly divided into low,medium,high-dose Egb groups and control group with 6 in each group.Intravenous infusion of 0.3ml/kg NS was given to the rabbits in control group,and 0.3ml/kg,1.5ml/kg,3ml/kg Egb761 were given to the rabbits in low,medium and high-dose Egb groups for 7d.After 1.5h of injection on d7,the blood samples were collected,and PLT,PT,APTT,PF3aT were examined. Results There were no significant differences in PLT,PT,APTT between control group and Egb761 groups(P＞0.05),while the PF3aT time in Egb761 groups was prolonged(P＜0.05). Conclusion Egb761 can affect platelet factor 3 and hinder the activation of platelet,leading to coagulation disorder in rabbits.

Injection ofginkgo bibola leaves extractRabbitCoagulation

2015-12-21）

（本文編輯：田云鵬）

321000 金華市中心醫(yī)院心胸外科（唐志苗），浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心胸外科（倪一鳴）

唐志苗，E-mail：tangzhimiao@163.com