母嬰分離致腸易激綜合征大鼠模型的建立與評價

滕衛軍 杜小雪 丁明星 陳浩浩 方遠書

母嬰分離致腸易激綜合征大鼠模型的建立與評價

滕衛軍 杜小雪 丁明星 陳浩浩 方遠書

目的 研究新生期母嬰分離導致腸易激綜合征（IBS）大鼠模型的建立及其對P物質與其受體NK1表達的影響。 方法 將64只新生期雄性大鼠隨機分為母嬰分離組（在出生后第2～21天，每天將新生大鼠與哺乳期母鼠分離3h）和對照組（不給予上述處理）。成年后（出生后60d）兩組大鼠均給予結直腸球囊擴張（CRD），用行為學觀察和腹部回縮反射(AWR)評分來評估內臟痛反應，用免疫組化方法檢測腰骶段脊髓背角P物質及其受體NK1的表達量，并進行遠端結腸常規組織學檢測。結果 引起母嬰分離組大鼠內臟痛反應的CRD壓力閾值[（19.22±9.26）mmHg]顯著低于對照組[（24.89±10.91）mmHg]，差異有統計學意義（P＜0.05）。在40、60和80mmHg壓力擴張下，母嬰分離組的AWR評分均顯著高于對照組（均P＜0.05）。CRD后母嬰分離組腰骶段脊髓背角P物質及其受體NK1蛋白免疫反應陽性細胞數與對照組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。母嬰分離組和對照組大鼠在CRD前后結腸均未見組織損傷或炎癥。結論 新生期母嬰分離能成功建立IBS大鼠模型，成年后在內臟刺激時產生過強的內臟痛反應和神經元活化反應，P物質及其受體NK1可能不參與其過程。

腸易激綜合征 新生期母嬰分離 P物質 NK1受體

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是臨床上最常見的功能性腸病，內臟感覺過敏是IBS病理生理特征之一，但確切機制依然不明[1]，因而建立合適的動物模型極為必要。研究發現，母嬰分離大鼠模型具有內臟痛覺過敏和應激后結腸運動加強，能較好模擬IBS患者的主要特征[2-3]。新生期母嬰分離對大鼠是一種早期生活事件，該大鼠模型成年后應激反應加強，這和部分IBS患者有早期生活事件病史以及應激反應加強的特點相似。本研究采用新生期母嬰分離方法建立IBS模型，檢測其內臟敏感性和感覺神經通路神經元活化及P物質與受體NK1的影響，旨在為探索IBS內臟感覺過敏的機制提供依據，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物分組 將出生后第1天的64只Sprague-Dawley雄性大鼠（由金華市實驗動物中心提供，許可證號SYXK（浙）2010-0151）分為8籠，每籠8只，每籠分配1只哺乳期母鼠。按隨機數字表法分為兩組：母嬰分離組和對照組（各32只），每組各4籠。母嬰分離組在出生后第2～21天，每天將新生大鼠與哺乳期母鼠分離3h；對照組在出生后第2～21天，不給予任何處理。飼養環境：每周半量換木屑墊料，出生后第22天斷奶，第30天分籠，每籠4只大鼠。晝-夜循環周期為12：12h（6：00開燈，18：00關燈），自由飲水飲食，室溫（20±1）℃。直到出生后第60天（體重280～320g）再進行其它操作。所有的實驗程序按照實驗動物中心的批準協議進行。

1.2 新生期母嬰分離 根據Coutinho和Tjong等[2-3]報道的方法略有調整，具體操作如下：9：00開始，將哺乳期母鼠從籠中拎出放入另一個單獨的籠中；然后將新生大鼠作為一個整群（每群8只）從籠中移出，放入另一個單獨的籠中（籠內鋪有3cm厚的木屑墊料），再將此籠轉移到隔壁房間，室溫為（20±1）℃；3h后，將新生大鼠反回最初籠中，使之在墊料上翻滾，然后將哺乳期母鼠放回，使母嬰團聚。

1.3 結直腸球囊擴張（colorectal distension,CRD）及行為學評估內臟敏感性 大鼠成年后（出生后60d）進行CRD：大鼠經2%異氟醚（含氧量為0.2L/min）麻醉后，將石蠟油潤滑后的帶氣囊的8F導尿管經肛門插入約6cm，用膠帶紙將導管纏繞固定在大鼠尾根部，導管經三通管連接10ml注射器和汞柱式血壓計，使球囊內壓力（代表結直腸內壓力）得以實時監控。然后將大鼠放在塑料平臺上（30cm×20cm），使之蘇醒并適應環境30min后，快速注氣使球囊壓力達到10mmHg，維持此壓力20s，然后抽出氣體使球囊內壓力降到0，4min后重復上述擴張過程，再同理依次分別給予20、40、60和80mmHg擴張壓力。CRD是一種機械性內臟刺激，可引起大鼠內臟運動反應-腹部回縮反射（abdominal withdrawal reflex,AWR），即腹部和后肢肌肉的收縮。AWR可用一個半定量評分系統來評估[4]，1分：結直腸擴張期間身體靜止不動，擴張初始偶有頭部扭動；2分：腹部肌肉輕微收縮，但腹部未抬離平臺面；3分：腹部肌肉明顯收縮，腹部抬離平臺面；4分：腹部肌肉強烈收縮，身體呈拱形，腹部和骨盆結構均抬離平臺面。取每個壓力強度下的2次AWR評分的均值作為該壓力強度下的AWR評分。觀察兩組引起明顯的內臟運動反應即可觀察到的腹部肌肉收縮（AWR評分2分）所需要的壓力閾值。每只大鼠的CRD持續時間由計時器嚴格控制。大鼠的行為學評估由一位觀察者獨立完成，該觀察者對大鼠的分組及處理不知情。

1.4 脊髓背角SP蛋白及NK1受體表達的檢測 取腰骶段脊髓（L6～S1）后固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液，進行脊髓切片的免疫熒光標記方法，步驟如下：漂洗切片于0.01mol/L的PBS緩沖液中，2×10min；孵育切片于包含0.3%Triton x-100和10%正常山羊血清的PBS緩沖液中，30min；去除上述阻斷液（不要漂洗）；孵育切片于一抗溶液中（小鼠抗大鼠P物質抗體，購自abcam公司，稀釋度為1∶500；兔抗大鼠NK1受體抗體，購自Sigma公司，稀釋度為1∶200，均稀釋于含0.3%Triton x-100和5%正常山羊血清的PBS緩沖液中）室溫下過夜；漂洗切片于0.01mol/L的PBS緩沖液中，3×10min；分別孵育切片于不同二抗溶液中（FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體，TRITC標記的山羊抗兔IgG抗體，購自Sigma公司，稀釋度為1∶500，稀釋于含0.3%Triton x-100和5%正常或兔山羊血清的PBS緩沖液中）室溫下2h；漂洗切片于0.01mol/L的PBS緩沖液中，3×10min；將切片用50%甘油（甘油和PBS緩沖液等體積混合）裱于經APES處理過的載玻片上，蓋上蓋玻片。免疫標記后，切片用Zeiss Axiophot 2顯微鏡觀察，用數碼相機及其配套軟件Spot 32攝取圖像，FITC和PE在激發下分別發出綠光和紅光，圖像獲得后，用Metamorph4.0軟件進行圖像定量分析。P物質在脊髓背角的陽性面積：在10×物鏡視野下獲取整個脊髓背角或中腦的圖像，用Metamorph4.0軟件進行分析，設置灰度閾值，超過此閾值的灰度被確定為陽性，得到雙側背角P物質陽性面積，結果表示為μm2/雙側背角。NK1受體在脊髓背角或中腦的表達：NK1受體免疫反應在脊髓背角的分布范圍用半定量評分來衡量，因為NK1免疫反應分布于Ⅰ層、Ⅲ～Ⅴ層、靠近中央管的Ⅹ層[5]，設定評分標準為1分：一個區域有免疫反應；2分：兩個區域有免疫反應；3分：三個區域有免疫反應；4分：更多區域有免疫反應。所有分析由一位對實驗分組和處理情況不知情的分析者完成。

1.5 結腸組織學觀察 結直腸擴張后，取大鼠遠端結腸（距肛門5～6cm）固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中，置于4℃冰箱中過夜，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明和浸臘包埋，切片（厚5μm）進行常規HE染色，觀察腸壁炎癥和損傷情況。

1.6 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件，測得計量資料采用表示，多組均數間的比較采用方差分析，行為學結果即壓力閾值和AWR評分用Mann-Whitney U非參數檢驗分析。

2 結果

2.1 兩組大鼠對CRD的壓力閾值以及不同壓力CRD的AWR評分比較 見表1。

表1 兩組大鼠對CRD的壓力閾值以及不同壓力CRD的AWR評分比較

由表1可見，母嬰分離組的引起明顯的內臟運動反應即可觀察到的腹部肌肉收縮（AWR評分2分）所需要的壓力閾值顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在10和20mmHg壓力擴張下，母嬰分離組的AWR評分和對照組無統計學差異（均P＞0.05）；而在40、60和80mmHg壓力擴張下，母嬰分離組的AWR評分顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.2 腰骶段脊髓背角SP和NK1P物質免疫反應分布和表達 P物質免疫反應分布于脊髓背角淺層（圖1）。定量分析發現，母嬰分離組和對照組在CRD前后，脊髓背角P物質陽性面積均無統計學差異（均P＞0.05）（表2）。NK1受體在脊髓背角廣泛分布，濃集分布于淺層，在深層和靠近中央管區域有陽性神經元和突起（圖2）。定量分析發現，母嬰分離組和對照組在CRD前后，脊髓背角NK1受體分布積分均無統計學差異（均P＞0.05），見表2。

圖1 P物質免疫反應在脊髓背角的分布和表達

圖2 NK1受體免疫反應在脊髓背角的分布和表達

表2 母嬰分離組和對照組脊髓背角SP和NK1受體的表達

2.3 結腸組織學觀察 母嬰分離組和對照組在CRD前后，均未見明顯組織損傷，亦未見中性粒細胞等炎性細胞浸潤（圖3、4）。

圖3 母嬰分離組結腸病理檢查所見（HE染色，×200）

圖4 對照組結腸病理檢查所見（HE染色，×200）

3 討論

本研究證實新生期母嬰分離大鼠模型具有內臟痛覺過敏應激后結腸運動加強，能較好模擬IBS患者的主要特征。早期生活應激原如童年被忽視、受虐待、失去父母等事件能增加IBS發生的危險性[6]。新生期母嬰分離是一種明確的早期生活事件，可致幼鼠中樞應激環路的永久改變和應激反應加強[7]，內臟感覺過敏[8]，這和部分IBS患者有早期生活事件病史以及應激反應加強的特點相似。

本研究還發現，母嬰分離組大鼠在更低的CRD壓力刺激下即可產生明顯的內臟運動反應，且母嬰分離組的AWR評分顯著高于對照組，說明成年后在內臟刺激時產生過強的內臟痛反應和神經元活化反應，但SP及其NK1受體與其無關。Ren等[9]用行為學觀察來半定量檢測結直腸擴張時內臟敏感性，同時以用腹部肌肉逐級收縮，AWR的數字評分來量化，隨刺激強度的增加而增加，用于檢測大鼠內臟傳入信息加工處理的改變，證明母嬰分離大鼠有內臟痛覺過敏。盡管P物質和NK1受體在炎癥時內臟痛傳輸和調節方面起重要作用[10]，但本實驗檢測了內臟傷害性刺激（CRD）時脊髓及中腦水平P物質和NK1受體的分布和表達時，未能發現有統計學差異，提示在母嬰分離致IBS內臟高敏對脊髓P物質的釋放和NK1受體的激活影響不大，也可能與IBS大鼠結腸本身炎癥不明顯有關，有待進一步研究。最近發現感染后IBS患者結腸黏膜P物質表達增加，而非感染感染后IBS患者結腸黏膜P物質表達與對照組無統計學差異[11]，支持我們的結果。本實驗大鼠結腸組織學結果發現，母嬰分離組和對照組大鼠腸道在CRD前后均沒有損傷和炎癥的改變，這與IBS缺乏病理學改變的特點相符合。

總之，本實驗使用容易獲得的SD大鼠，經新生期母嬰分離方法建立模型，檢測發現該大鼠模型內臟運動反應和脊髓背角神經元反應均較對照組大鼠顯著增加，但SP及其NK1受體表達不受影響，證實其具有內臟感覺過敏，而且不伴有腸道病理改變，符合IBS內臟感覺過敏的特點。

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（本文編輯：沈昱平）

《浙江醫學》“病例討論”欄目征稿

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本刊編輯部

Establishment of irritable bowel syndrome rat models with neonatal maternal separation method

TENG Weijun,DY Xiaoxue,DING Mingxing,et al.Department of Gastroenterology,Jinhua Hospital of Zhejiang University,Jinhua 321000,China

Objective To establish a rat model of irritable bowel syndrome with neonatal maternal separation method. Methods Male neonatal SD rats were randomly divided into 2 groups:in maternal separation(MS)group,the rats were exposed to a 3-h daily maternal separation from d2 to d21,and rats in control group were not exposed to maternal separation.The colorectal balloon distension(CRD)was performed 60d after birth for assessment of abdominal withdrawal reflex(AWR),a surrogate marker of visceral pain.Lumbar-sacral spinal cords were harvested for semi-quantitative analysis of substance (SP)and its receptor NK1 in the dorsal horn using immunohistochemical methods.The distal colons were examined with histological analysis before and after CRD. Results Pain threshold was significantly lower in MS than that in control group(19.22±9.26mmHg vs.24.89± 10.91mmHg,P＜0.05).The AWR score in response to CRD in MS group was significantly higher than control group at high distension pressures(40 mmHg:3.49±1.40 vs.2.80±1.34;60 mmHg:3.78±1.11 vs.3.16±1.21；80 mmHg:4.26±1.35 vs. 3.61±1.01;P＜0.05).There was no significant difference in the number of SP and NK1 receptor-positive neuron at dorsal horn of lumbar-sacral spinal between MS and control group(38.07±9.21 vs.39.85±8.29;2.26±0.54 vs.2.63±0.79,P＞0.05）after CRD.There was no tissue injury or inflammation in distal colon both in MS and control groups before and after CRD. Conclusion Prior neonatal maternal separation stress predisposes rats to exaggerated neurochemical responses and visceral hyperalgesia in adulthood without inducing structural alterations in colon,which mimic the features of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome,and SP and its NK1 receptor may be not involved in the process.

Irritable bowelsyndrome Neonatalmaternalseparation Substance P(SP)NK1 receptor

2015-11-11）

浙江省科技廳實驗動物科技計劃項目（2013C37032）

321000 浙江大學金華醫院消化科（滕衛軍）；浙江大學神經科學研究所（杜小雪）；金華職業技術學院醫學院（丁明星、陳浩浩）；金華市實驗動物中心（方遠書）