3-甲基腺嘌呤對EPCs超微結構和LC3-Ⅱ蛋白表達的影響研究

朱人大 李曉強

3-甲基腺嘌呤對EPCs超微結構和LC3-Ⅱ蛋白表達的影響研究

朱人大 李曉強

目的 探索3-甲基腺嘌呤（3-MA）對大鼠骨髓源性內皮祖細胞（EPCs）超微結構和自噬體膜型（LC3-II）蛋白表達的影響。方法采用密度梯度法取大鼠骨髓EPCs，體外誘導分化并鑒定；分成對照組和4個3-MA濃度組（分別加入1．25、2．5、5、10mmol/L 3-MA)。采用單丹（磺）酰戊二胺（MDC）熒光染色和透射電鏡觀察3-MA給藥后EPCs自噬的發生。Western blot檢測3-MA給藥后EPCs內LC3-II蛋白表達的變化。結果MDC熒光染色和透射電鏡均觀察到5、10 mmol/L組EPCs超微結構明顯區別于正常及死亡細胞，是典型的凋亡形態圖。Western blot檢測3-MA給藥24h后EPCs LC3-II蛋白表達降低；與對照組比較，5、10 mmol/L組LC3-II蛋白表達明顯降低（P＜0．05）。結論5、10mmol/L的3-MA對EPCs超微結構和LC3-II蛋白表達均有影響，推測濃度≥5mmol/L的3-MA能抑制EPCs的自噬。

內皮祖細胞 單丹（磺）酰戊二胺 3-甲基腺嘌呤

Asahara等[1]于1997年首次詳細描述了內皮祖細胞（EPCs）在缺血組織新生血管形成中的作用，近年來EPCs已成為研究熱點[2-4]。深靜脈血栓形成（DVT）是一種臨床常見病、多發病，據統計，美國每年至少有500萬人患DVT，我國每年DVT新發病例超過25萬，目前主要有保守治療和手術取栓兩種治療方法，對于7d內急性期血栓效果尚可，對于慢性期血栓的效果欠佳。選擇更為有效的治療方法來提高DVT治愈率、降低后遺癥發生率以及促進血栓再通是當前的研究熱點。我們前期研究發現EPCs能改變血栓的微環境，而血栓機化、再通均與微環境密切相關，將經鑒定的EPCs移植到慢性血栓中，能有效促進血栓機化與再通[5]。3-甲基腺嘌呤（3-MA）是當前公認的自噬抑制劑，前期實驗證實一定濃度的3-MA可促進EPCs增殖，本研究進一步檢測各種濃度3-MA對EPCs自噬的抑制作用，以探討其對細胞超微結構和自噬體膜型（LC3-Ⅱ）蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及檢測儀器 3周齡的Wistar大鼠20只，體重50～80g，雌雄不限，由中國生命科學院上海實驗動物中心提供；EGM-2MV EPCs培養基，美國Chemicon公司生產；3-MA、單丹（磺）酰戊二胺（MDC）、βactin（A5441）抗體、FITC-二抗，均由美國Sigma公司生產；BCA蛋白定量試劑盒，美國Pierce公司生產；LC3抗體，美國Santa Cruz公司生產；TMB顯色液（TMB Stabilized Substrate for HRP），Promega公司生產。倒置顯微鏡（Olympus）、倒置熒光顯微鏡（eclipse TE2000-U型），由蘇州大學血液研究所提供，日本Nikon公司生產；切片機（LKB-1型）、透射電鏡（CM-120型）均由上海復旦大學醫學院電鏡室提供，荷蘭Philips公司生產。

1.2 方法

1.2.1 EPCs培養、鑒定 無菌條件下分離出大鼠股骨，沖出骨髓，制成單細胞懸液備用。加入EPCs培養基（EGM-2MV），青、鏈霉素以（0.8～1.0）×106/cm2密度接種于培養瓶，5%CO2、37℃環境下培養。培養至第12天，PBS洗滌，貼壁細胞備用。用免疫組化和免疫熒光鑒定EPCs特異性標志VEGFR-2、CD34和CD133的表達。

1.2.2 實驗分組 細胞培養12d，胰蛋白酶消化、重懸呈單細胞懸液，分為5個實驗組，即對照組（僅加入EGM-2MV）、3-MA組（分別加入1.25、2.5、5、10mmol/L 3-MA），并于24h后收集細胞，計算每組細胞數量并作及時調整，使各組細胞數量基本相等。

1.2.3 MDC熒光染色檢測 （1）MDC染色液配制：取MDC粉末溶于二甲基亞砜中，終濃度為0.1mol/L，分裝后-20℃保存；臨用前用EGM-2MV培養基稀釋為50μmol/L。（2）MDC熒光染色：取對數生長期EPCs，調整細胞濃度后接種于24孔板，次日給予含各濃度3-MA的EGM-2MV，對照組僅加入培養基；給藥24h后改用含MDC的新鮮培養基孵育10min；PBS洗滌細胞2次；用紫外線激發，在倒置熒光顯微鏡下觀察、攝片。

1.2.4 透射電鏡觀察3-MA對EPCs超微結構的影響（1）取對數生長期EPCs，在對照組和3-MA（5、10mmol/ L）的EGM-2MV培養基給藥24h后收集細胞，PBS離心洗滌，將細胞收集于離心管中；（2）固定；（3）脫水；（4）浸透；（5）固化；（6）LKB-1型超薄切片機切片（50～60nm）；（7）3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色；（8）Philips CM-120透射電鏡下觀察、攝片。

1.2.5 Western blot檢測觀察3-MA對EPCs LC3蛋白表達的影響 （1）樣品制備：對照組與不同濃度3-MA組，24h后收集細胞，PBS洗滌，用細胞刮刀刮下細胞，細胞懸液充分離心，往沉淀中加入適量含PMSF的細胞裂解液（PMSF：裂解液=1∶50），吹勻，置冰上30min以充分裂解細胞；加入5×樣品緩沖液，100℃煮沸8min，離心10min，取上清液，樣品即可使用，也可-20℃凍存備用。（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。（3）Western blot檢測蛋白轉膜。（4）蛋白質免疫檢測：封閉、一抗、洗膜、二抗、洗膜、TMB顯色。（5）圖像分析：用Image J軟件得出圖片中目的條帶灰度值，并除以內參GAPDF灰度值，得出該樣品目的蛋白相對含量；每組數據重復測量3次。

1.3 統計學處理 使用SPSS13.0統計軟件，計量資料滿足方差齊性，用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 MDC熒光染色檢測3-MA對EPCs的自噬作用給藥24h后，對照組、1.25mmol/L組和2.5mmol/L組均有點狀熒光顆粒散布于EPCs細胞質內，而5、10mmol/L組的EPCs細胞質內無熒光顆粒出現，見圖1。

圖1 對照組與不同濃度3-MA給藥24h后EPCs倒置熒光顯微鏡下所見（MDC熒光染色，×400）

2.2 透射電鏡觀察3-MA對EPCs超微結構的影響 細胞培養12d后電鏡下觀察，對照組細胞質內線粒體、溶酶體等細胞器，細胞核及核內染色體形態與分布均正常，見圖2A；細胞質內有少量明顯的獨立雙層膜結構自噬囊泡出現，見圖2B。5、10mmol/L組給藥24h后，可以觀察到細胞質發生固縮，染色質濃縮、邊集，呈境界分明的半月狀或塊狀附于核膜，可見到細胞核發生固縮、斷裂，這種超微結構明顯區別于正常及死亡細胞，是典型的凋亡形態圖，見圖2C、2D。對照組細胞質中出現獨立雙層膜結構自噬囊泡，加藥組中沒有出現獨立雙層膜結構自噬囊泡和自噬溶酶體。加藥組細胞質內部分線粒體發生腫脹、變圓，個別細胞空泡化，基質變淺，嵴變少，出現縱向嵴和同心圓嵴，可見到空泡狀的粗面內質網。在整個觀察中，未見細胞腫脹等壞死形態特征出現，見圖2。

2.3 不同濃度3-MA給藥24h后EPCs LC3-Ⅱ蛋白表達 給藥24h后，與對照組 （0.9936±0.052）比較，1.25mmol/L組（0.9654±0.039）、2.5mmol/L組（0.9513±0.036）LC3-Ⅱ蛋白表達變化不明顯（均P＞0.05），而5mmol/L組（0.7604±0.051）、10mmol/L組（0.7007±0.020）LC3-Ⅱ蛋白表達明顯降低（均P＜0.05）。

圖2 透射電鏡下EPCs超微結構（A：對照組細胞核內常染色質較多，細胞質內線粒體等細胞器形態、分布均正常；B：對照組細胞質內可見自噬雙層膜結構；C：5mmol/L組給藥24h后可見核內染色質邊集，異染色質增多，細胞質內線粒體發生腫脹、變圓，未見到明顯的自噬雙層膜結構；D：10mmol/L組給藥24h后可見核固縮、斷裂，細胞質內線粒體發生腫脹，嵴變少、變圓，未見到明顯的自噬囊泡和自噬溶酶體）

3 討論

自噬是真核細胞中廣泛存在的生命現象，是生物發育、老化過程中凈化自身多余或受損細胞器的共同機制。由于細胞自噬的發生與Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸激酶（PI3K）關系密切，PI3K的抑制劑可以干擾或阻斷自噬體形成，而特異性自噬抑制劑3-MA通過這種方式發揮作用[6]。

本研究觀察3-MA對EPCs超微結構和LC3-Ⅱ蛋白表達的影響，受當前檢測方法的限制，全面深入研究自噬仍是一大難題。MDC是一種特異性自噬標記物，可被細胞吸收并選擇性地聚集于自噬囊泡中，在熒光顯微鏡下可觀察到染上MDC熒光的自噬囊泡呈點狀結構，散布于細胞質和細胞核周圍；因此可根據細胞內熒光顆粒變化來推斷自噬的活化[7]。透射電鏡可形象觀察到獨立雙層膜、自噬體等自噬過程中各形態變化，是可靠的自噬檢測手段[8]。實驗結果顯示給藥24h后，對照組、1.25mmol/L組和2.5mmol/L組細胞質中有點狀熒光顆粒散布于EPCs細胞質內，而5、10mmol/L組均無熒光顆粒出現；以上提示5、10mmol/L的3-MA給藥24h后自噬囊泡和熒光顆粒明顯減少，提示已抑制EPCs自噬的發生；1.25、2.5mmol/L組細胞質中可見明顯的熒光顆粒，說明低濃度3-MA尚不能完全抑制EPCs自噬的發生。細胞培養12d后電鏡下觀察，對照組細胞質內線粒體、溶酶體等細胞器，細胞核及核內染色體的形態與分布均正常，細胞質內出現少量明顯的獨立雙層膜結構自噬囊泡；而5、10mmol/L組給藥24h后，可以觀察到細胞質發生固縮，染色質濃縮、邊集，呈境界分明的半月狀或塊狀附于核膜，可見到細胞核發生固縮、斷裂，這種超微結構明顯區別于正常及死亡細胞，為典型的凋亡形態圖。對照組細胞質中出現獨立雙層膜結構自噬囊泡，而加藥組無明顯的獨立雙層膜結構自噬囊泡和自噬溶酶體出現。此外，加藥組細胞質內部分線粒體發生腫脹、變圓，個別細胞空泡化，基質變淺，嵴變少，出現縱向嵴和同心圓嵴，可見到空泡狀的粗面內質網。在整個觀察中，未見細胞腫脹等壞死形態特征的出現。

自噬相關蛋白Atg8是含117個氨基酸的蛋白，早期的獨立膜、自噬體及自噬小體表面均有此蛋白。LC3是Atg8的哺乳動物類似物，能靶向定位于自噬體膜，并始終保留在膜上，與磷脂酰乙醇胺的泛素樣結合，自噬誘導發生后，在Atg3的催化下，磷脂酰乙醇胺結合至LC3-ⅠC端甘氨酸殘基，生成脂溶性LC3-Ⅱ，是自噬過程中膜動力學很好的標志物，也是目前可靠的自噬體標志物[9-10]。LC3-Ⅱ含量多少與自噬囊泡多少成正比，LC3-Ⅱ被認為是自噬標志分子。通過檢測細胞內LC3-Ⅱ含量可以判斷自噬被誘導或抑制[10]。實驗結果表明，與對照組比較，1.25、5mmol/L組EPCs LC3-Ⅱ蛋白表達變化不明顯，5、10mmol/L組給藥24h后LC3-Ⅱ蛋白表達明顯降低，且有濃度依賴性。故推測濃度≥5mmol/L的3-MA能抑制EPCs的自噬。

本研究初步探討了幾種不同濃度的自噬抑制劑3-MA對EPCs自噬的影響，為抑制自噬來提高EPCs活力和數量、促進血栓機化再通提供依據。

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Effect of 3-methlyadenineon ultrastructure and LC3-II expression of rat endothelial progenitor cells

ZHU Renda. LI Xiaoqiang. Department of Vascular Surgery. the Second Affiliated Hospital of Soochow University. Suzhou 215004. China

Objective To investigate the effect of 3-methlyadenine(3-MA)on ultrastructure and LC3-II protein expression in rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells(EPCs)．MethodsMononuclear cells(MNCs)were isolated from rat bone marrow;the EPCs were induced from cultured MNCs and identified．The induced rat EPCs were treated with different concentrations of 3-MA(0,1．25,2．5,5,10mmol/L)．Monodansylcadaverine staining and transmission electron microscopy(TEM) were used to examine cell autophagy induced by 3-MA in rat EPCs．Western blot analysis was used to detect the LC3-II protein expression．ResultsAutophagy inhibition was observed in EPCs by 3-MA at concentration of 5mmol/L and 10mmol/L by both MDC staining and TEM．LC3-II protein expression in EPCs was decreased aftertreatment of 5mmol/L and 10mmol/L 3-MA as detected by western blot(P＜0．05)．ConclusionHigh dose of 3-MA caninduce the ultrastructural changes and reduce LC3-II expression in rat bone marrow-derived epithelial progenitor cells．

Endothelial progenitor cellMonodansylcadaverine 3-methlyadenine

2015-04-28）

（本文編輯：陳丹）

國家自然科學基金資助項目（30972941）

215004 蘇州大學附屬第二醫院血管外科（朱人大、李曉強，朱人大系全日制研究生，現在海寧市人民醫院血管外科工作）

李曉強，E-mail：flytsg@126.com