不同劑量富氫氣生理鹽水對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的治療作用觀察

謝建平 王趙偉 吳承龍

不同劑量富氫氣生理鹽水對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的治療作用觀察

謝建平 王趙偉 吳承龍

目的 探討富氫氣生理鹽水對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠的治療作用及最佳劑量范圍。方法用豚鼠脊髓勻漿與完全弗氏佐劑免疫SD大鼠制作EAE模型；造模成功后第1～20天大鼠腹腔注射不同劑量（0、3、6ml/kg）富氫氣生理鹽水，觀察并記錄大鼠體重、行為學評分；第21天處死大鼠取腦、脊髓作HE染色，檢測脊髓IL-17、INF-γ表達水平以及血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。結果6ml/kg富氫氣生理鹽水劑量組臨床發病率較低，僅為30．0%；且發病后能抑制體重下降，最高臨床評分與累積臨床評分均最低，中樞組織炎癥細胞浸潤最少。3、6ml/kg劑量的富氫氣生理鹽水均能抑制EAE大鼠IL-17、INF-γ的釋放，提高SOD活性；但6 ml/kg劑量效果更佳。結論6ml/kg劑量的富氫氣生理鹽水可能對降低EAE大鼠臨床發病率有積極作用，且能抑制發病大鼠體重下降，降低神經缺損行為學評分，并能促進SOD活性，從而抑制EAE。

氫氣 實驗性自身免疫性腦脊髓炎 SOD IL-17 INF-γ

氫元素在地球豐度頗高，且具有較強的還原性，因此廣泛應用于新能源電池開發。現代醫學研究發現，氫氣可在人體腸道內由細菌代謝產生，并廣泛存在于內環境中，可選擇性清除羥自由基和過氧亞硝基陰離子而具有抗氧化應激與抗細胞凋亡的作用[1]。此外，富氫氣生理鹽水可以抑制腦、心、肝、腎、肺等臟器的缺血再灌注損傷[2-3]，對神經系統退行性疾病也有一定的治療作用[4]。多發性硬化是一種慢性炎癥性脫髓鞘性自身免疫性中樞神經系統疾病，可導致進行性神經損害與殘疾[5]，發病機制可能與遺傳、易感人群及受到環境因素影響而導致免疫耐受平衡紊亂有關。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）動物模型是人類多發性硬化的理想動物模型，它們有相似的臨床表現、免疫特性及組織病理學特征[6]。神經源性抗原免疫誘導EAE后，可觀察到中樞神經系統出現炎癥細胞浸潤與髓鞘脫失；還會出現中樞神經系統內抗原特異性Th1、Th17淋巴細胞增殖、局限性的炎癥反應、髓鞘脫失和神經壞死等[7]。在脫髓鞘疾病免疫攻擊階段，大量免疫細胞被活化并釋放炎癥介質，存在著氧化應激、釋放氧自由基過程，而氫氣能否抑制這一過程尚未明確。本研究通過制作EAE大鼠模型并在其腹腔內注射不同劑量富氫氣生理鹽水，觀察大鼠的體重與行為學改變，脊髓組織病理變化，IL-17、INF-γ表達及血清超氧化物歧化酶（SOD）活性改變，以探討富氫氣生理鹽水對EAE是否有治療作用及最佳治療劑量范圍。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 富氫氣生理鹽水（上海第二軍醫大學潛水醫學教研室），IL-17與INF-γ酶聯免疫吸附法試劑盒（MIF00、M1700，美國安迪生物科技有限公司），完全弗氏佐劑（F5881-10X10ML，美國Sigma-Aldrich公司），百日咳毒素與卡介苗（中國食品藥品檢定研究院），總蛋白定量測定試劑盒與超氧化物歧化酶檢測試劑盒（A045-3-96T，南京建成生物工程研究所）；酶標儀（684，美國BIO-RAD公司），可見分光光度計（722，上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 實驗動物與EAE模型制作 180～200g白色豚鼠17只，用于制作脊髓勻漿；8周齡220～250g且造模成功的SD大鼠（清潔級）35只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。EAE模型制作參照以往操作流程[8]，主要步驟包括：用注射器來回抽打豚鼠脊髓勻漿和完全弗氏佐劑（CFA，1∶1體積）成油包水乳劑，皮下注射于大鼠四肢足墊（0.4ml/只）；注射當天與之后48h，腹腔注射百日咳毒素1ml（1×109菌體）。CFA組用生理鹽水代替豚鼠脊髓勻漿，再與CFA等體積混勻為乳劑后注射于大鼠四肢足墊，百日咳毒素處理與EAE組一致。大鼠尾部或肢體出現無力表示造模成功，成模率為76.7%。

1.3 模型分組及對照治療 將造模成功的35只大鼠隨機分為4組：CFA對照組5只，僅于大鼠足底皮下注射CFA；EAE對照組10只，造模成功后第1～20天每日腹腔注射生理鹽水；3ml/kg富氫氣生理鹽水治療組10只，造模成功后第1～20天每日腹腔注射3ml/kg富氫氣生理鹽水；6ml/kg富氫氣生理鹽水治療組10只，造模成功后第1～20天每日腹腔注射6ml/kg富氫氣生理鹽水。

1.4 行為學評價 行為學評價指標有臨床發病率、最高臨床評分和累積臨床評分。臨床評分依據Kono等[9]報道的行為學標準：無明顯異常為0分，尾巴無力為1分，輕微后肢無力為2分，嚴重后肢麻痹為3分，四肢麻痹為4分，瀕死或死亡為5分。

1.5 大鼠標本處理 造模成功后第20天將4組大鼠用10%水合氯醛麻醉后統一處死；取其腦和脊髓在4%多聚甲醛中固定24h。常規脫水、透明、浸蠟制成蠟塊，切片后用HE染色，在光學顯微鏡下觀察組織病理變化。部分脊髓組織立即凍存于液氮，并轉移至-70℃冰箱保存，用于炎癥介質檢測。處死前，尾靜脈抽取血液標本，經離心（500g）獲得血漿，凍存于-70℃冰箱，用于SOD檢測。

1.6 血漿SOD檢測 冰凍血漿經融化達到室溫后，采用黃嘌呤氧化酶法進行SOD活性檢測：在測定管分別加入試劑一1ml、血漿0.1ml、試劑二0.1ml、試劑三0.1ml、試劑四0.1ml；在對照管分別加入試劑一1ml、雙蒸水0.1ml、試劑二0.1ml、試劑三0.1ml、試劑四0.1ml；經旋窩混勻器混勻后于37℃恒溫水浴40min，加入顯色劑2ml，室溫靜置10min，選擇550nm波長、1cm光徑比色杯，經蒸餾水調零后，上機檢測吸光度值；根據吸光度值換算獲得SOD活性值。

1.7 脊髓IL-17與INF-γ表達水平檢測 （1）脊髓勻漿上清液總蛋白濃度測定：保存于-70℃冰箱的脊髓組織經室溫解凍后，立刻在細胞裂解液中勻漿；取標準品與組織上清液稀釋、加樣，37℃溫浴30min，加終止液混勻5min；選擇562nm波長上機檢測各管吸光度值，根據吸光度擬核標準曲線，并計算各樣品總蛋白濃度。（2）ELISA法檢測IL-17與INF-γ濃度：試劑盒及脊髓勻漿液標本靜置達室溫后，用移液器添加50μl稀釋液到酶標板各孔內，分別添加標準品、對照液、血漿樣品50μl到相應各孔內，酶標板覆蓋塑料蓋板后室溫孵育2 h，甩干各孔并洗滌5次，加入100μl偶聯化合物至各孔，室溫孵育2 h，甩干各孔并洗滌5次，加入100μl底物液后室溫避光孵育30min，加入100μl終止液；選擇450nm波長（以540nm為對照波長）在30min內完成上機檢測，根據吸光度擬核標準曲線，并計算各樣品IL-17與INF-γ濃度；（3）通過IL-17或INF-γ濃度/總蛋白濃度進行標準化，以表示脊髓IL-17或INF-γ表達水平。

1.8 統計學處理 應用SPSS 16.0統計軟件，計量資料用表示，神經缺損行為學評分、體重等多樣本均數比較采用方差分析，其余均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠體重變化 造模成功后第9天，除CFA組體重增加外，其余3組均出現體重下降；第11～20天，CFA組大鼠體重與其余3組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；第18～20天，EAE組大鼠體重均明顯低于6 ml/kg組（均P＜0.05），而與3ml/kg組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠日均體重變化

2.2 大鼠行為學評分變化 EAE組大鼠臨床發病率最高（80.0%），3ml/kg組次之（50.0%），6ml/kg組較低（30.0%）。3ml/kg組、6ml/kg組最高臨床評分均低于EAE組（均P＜0.05）；而3ml/kg組與6 ml/kg組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模成功后第1～20天累積臨床評分比較，3ml/kg組、6ml/kg組均低于EAE組（均P＜0.05）；3ml/kg組高于6ml/kg組（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠臨床發病率及行為學評分

2.3 脊髓組織病理檢查結果 CFA組大鼠脊髓病理切片中未見明顯炎癥反應，偶見少量單核細胞；EAE組可見典型的淋巴袖套形成，數量較多，脊膜下可見明顯的炎癥細胞浸潤；3ml/kg組可見少量典型的淋巴袖套，炎癥細胞集中在脊髓膜下；6ml/kg組可見散在的淋巴細胞浸潤，分布稀疏，極少見到典型的淋巴袖套，見圖2。

圖2 脊髓組織病理檢查結果（A：CFA組腰髓，正常脊髓；B：EAE組腰髓，大量淋巴細胞浸潤；C：3ml/kg組腰髓，可見炎癥細胞浸潤；D：6ml/kg組腰髓，可見少量炎癥細胞浸潤；HE染色，×400）

2.4 造模后各組大鼠血清SOD活性變化 除CFA組外，其余3組大鼠SOD活性在造模后第9、14、19天均明顯下降。與CFA組比較，EAE組大鼠SOD活性在以上3個時間點均明顯下降（均P＜0.01）；與EAE組比較，3ml/kg組、6ml/kg組SOD活性在以上3個時間點明顯升高（均P＜0.01）。6ml/kg組與3ml/kg組大鼠SOD活性比較，第19天6ml/kg組較高（P＜0.05），其余2d差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 造模后各組大鼠血清SOD活性變化（U/ml）

2.5各組大鼠脊髓IL-17與INF-γ表達水平變化 EAE組炎癥介質IL-17與INF-γ表達水平均高于CFA組（均P＜0.01）；與EAE組比較，6ml/kg組、3ml/kg組大鼠脊髓IL-17、INF-γ表達水平均明顯下降（均P＜0.05）；6ml/kg組與3ml/kg組的IL-17、INF-γ表達水平比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠脊髓IL-17與INF-γ表達水平

3 討論

多發性硬化是以中樞神經系統白質脫髓鞘，炎癥細胞浸潤并伴有軸突損傷為特點的神經系統自身免疫性疾病。EAE模型多發性硬化的經典動物模型，具有相似的免疫學機制[9]。通過神經源性抗原免疫誘導EAE后，可觀察到中樞神經系統出現炎癥細胞浸潤與髓鞘的脫失。誘導EAE后還會出現中樞神經系統內抗原特異性Th1、Th17淋巴細胞增殖、局限性的炎癥反應、髓鞘脫失和神經壞死等。Th1、Th2、Th17和Treg淋巴細胞則與EAE疾病的發生、發展密切相關。

Treg淋巴細胞占人類外周血單個核淋巴細胞的1%～2%，占CD4+T細胞的5%～10%。骨髓制造的幼稚T淋巴細胞可在胸腺發育成熟；Treg淋巴細胞也能被TGF-β、致耐受性樹突狀細胞或特異性抗原持續刺激所誘導成熟。Treg細胞在抑制針對自身抗原的病理性免疫反應、感染恢復與維持免疫穩態等方面具有重要作用。Th1、Th17參與促進炎癥過程，并釋放IL-17、INFγ；炎癥細胞在IL-17、INFγ等介導下最終導致呼吸暴發，產生大量氧自由基，導致氧化應激，加重中樞炎癥損傷[10]。SOD是生物體內最重要的抗自由基活性酶類，其活性很大程度上決定個體的抗氧化應激能力，即體現EAE發病的抵抗能力。

目前認為氫氣對抗氧化應激作用顯著，具有廣泛的應用前景[11]。本實驗通過制作EAE模型并腹腔注射富氫氣生理鹽水，從EAE動物體重變化、神經缺損行為學評分、組織學檢測結果、致病性炎癥介質等方面評價富氫氣生理鹽水對EAE的抑制作用，發現6ml/kg劑量效果最佳。但本研究未使用更高劑量，建議進一步研究更大劑量富氫氣生理鹽水是否能達到更好的治療效果或可能出現的不良反應。此外，本研究發現全程使用富氫生理鹽水可能對降低大鼠EAE臨床發病率有積極作用；但本研究樣本量不足，故未見統計學差異，建議今后擴大樣本量作進一步研究。我們還發現富氫氣生理鹽水治療組大鼠發病過程中血清SOD活性水平明顯升高，其抗氧化應激儲備能力明顯增強，可能與氫氣直接中和強自由基和過氧亞硝基陰離子，從而減少了SOD損耗有關[12]。對于氫氣是否能直接調節SOD活性或促進SOD酶蛋白表達，需進一步研究。IL-17、INF-γ是EAE的致病炎癥介質之一[13]，本研究發現氫氣可以抑制IL-17表達，且可能參與調節IL-17表達或Th17細胞活化增殖的信號通路。

本研究初步認為氫氣可以抵抗EAE大鼠中樞炎癥，6 ml/kg劑量的富氫生理鹽水療效較好；氫氣對EAE治療作用可能與升高SOD水平、抑制IL-17有關。氫氣抑制IL-17表達的具體信號通路、促進SOD活性的具體機制等有待深入研究。

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Effects of hydrogen-rich saline against experimental autoimmune encephalomyelitis in SD rats

XIE Jianping. WANG Zhaowei. WU Chenglong. Department of Neurology. Shaoxing People's Hospital. Shaoxing 312000. China

Objective To investigate the effect of hydrogen-rich saline on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)．MethodsEAE was induced by injection of spinal cord homogenate of guinea pig with complete Freund's adjuvant(CFA) in SD rats．From the 1st day to the 20th day after EAE induced,the rats received peritoneal injection of hydrogen-rich saline(0,3, 6ml/kg)．On the 21th day,all rats were sacrificed;paraffin sections of spine cord were prepared and stained with hematoxylin-eosin to detect inflammatory cell infiltration．The expression of IL-17 and INF-γin the spinal cord was determined by ELISA and serum SOD activity was determined on the 10th,15th and 20th after EAE induced．ResultsThe incidence of EAE in hydrogen-rich saline 6ml/kg group was lowest(30．0%)among 3 groups．Hydrogen-rich saline 6ml/kg inhibited the weight reduction and reduced the neurobehavioral deficits scores．It also reduced the inflammatory cell infiltration in the spinal cord of EAE rats and the expression of IL-17 and INF-γ,while increased the level of SOD．The degree of weight reduction was not reduced by given 3ml/kg hydrogen-rich saline,while it reduced the neurobehavioral deficits scores and the inflammatory cell infiltration in spinal cord and the expression of IL-17 and INF-γand up-regulated the SOD level．ConclusionHydrogen-rich saline can reduce the severity of EAE,which may be associated with its antioxidant effect and the up-regulation of serum SOD．

Hydrogen Experimental autoimmune encephalomyelitis SOD IL-17 INF-γ

2015-11-30）

（本文編輯：陳丹）

浙江省醫藥衛生科技項目（2015ZHB014）

312000 紹興市人民醫院神經內科

吳承龍，E-mail：wuchlo7666@126.com