黃酒多酚對Hcy誘導的血管平滑肌細胞MMP-2/9表達與活性的影響

劉龍斌 孟立平 季政 許富康 池菊芳 郭航遠

黃酒多酚對Hcy誘導的血管平滑肌細胞MMP-2/9表達與活性的影響

劉龍斌 孟立平 季政 許富康 池菊芳 郭航遠

目的 探討黃酒多酚（YWPC）對同型半胱氨酸（Hcy）誘導的大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達和活性的影響及其信號通路。方法 SD大鼠主動脈VSMCs原代細胞培養鑒定，取4～7代細胞用于實驗。YWPC組VSMCs分別用1、10、100mg/L的YWPC干預，采用Western blot法檢測VSMCs中MMP-2、MMP-9、AKT、pAKT的表達情況；明膠酶譜檢測VSMCs中MMP-2和MMP-9的活性。用IGF-1（3ng/ml）干預VSMCs 8 h激活PI3K/AKT通路后，用YWPC干預VSMCs，檢測MMP-2、MMP-9的表達和活性。結果 Western blot結果顯示，與Hcy組比較，YWPC組VSMCs中MMP-2/9的表達減少，pAKT表達減少（均P＜0.01）；明膠酶譜結果顯示，與Hcy組比較，YWPC組VSMCs中MMP-2/9的活性降低。在加入IGF-1后,與對照組比較，IGF-1組VSMCs中pAKT、MMP-2/9的表達和活性增加（P＜0.01）；與YWPC組比較，YWPC+IGF-1組VSMCs中pAKT、MMP-2/9的表達和活性增加（P＜0.01）。結論 YWPC通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制Hcy誘導的VSMCs中MMP-2/9的表達和活性。

血管平滑肌細胞 黃酒多酚 PI3K/AKT 基質金屬蛋白酶

黃酒采用紅粬、糯米和水為原料，人工自然發酵釀制而成。現已證實黃酒中含有豐富的多酚、氨基酸、多肽、維生素、低聚糖、有機酸以及礦物質等有益于心腦血管健康的成分[1]。我們過去的研究已經證實黃酒不但可以抑制大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖和遷移，而且可以抑制LDLR-/-小鼠動脈粥樣硬化形成[2-4]。大量的研究證實規律適量的飲用紅酒具有心血管保護作用[5-6]，并且已經闡明紅酒的心血管保護作用主要緣于其中的多酚類成分[7]。我們推測，黃酒主要也是通過多酚類物質發揮其心腦血管保護作用。基質金屬蛋白酶（MMPs）和組織型基質金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）共同維持著細胞外基質的平衡，在動脈粥樣硬化斑塊的發生、發展中具有重要的作用[8-10]。本實驗旨在研究黃酒多酚（YWPC）抑制同型半胱氨酸（Hcy）誘導的VSMCs中MMP-2/9的表達以及是否通過抑制PI3K/AKT途徑來實現這一作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 SPF級SD大鼠購自浙江省醫學科學院實驗動物中心，雌雄不限，60d左右，體重150～180g；遺傳背景為C57BL/6J 10代后雄性LDLR-/-小鼠（購于南京醫科大學實驗動物中心）。YWPC由上海中藥制藥技術有限公司分離提取，純度約60%；乙醚、甲醇、75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、甲醇購自杭州化學試劑有限公司；DMEM高糖培養基、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和鏈霉素購自杭州吉諾公司；Hcy、雷帕霉素購自美國Sigma公司；DMSO購自美國MP Biomedicals公司，FBS購自美國GIBCO公司，MTT購自美國Emresco公司；DAPI購自瑞士Rcohe公司；兔抗akt、p-pakt多克隆抗體、兔抗大鼠SM-actin單克隆抗體、兔抗MMP-2/ 9、明膠購自美國ABCOM公司；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、FITC標記的山羊抗兔IGg購自美國Jackson公司；蛋白免疫印跡以及明膠酶譜相關試劑購自江蘇碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 VSMCs原代細胞培養及鑒定采用組織貼塊法培育大鼠胸主動脈VSMCs，采用形態學觀察和細胞免疫熒光檢測平滑肌肌動蛋白（SM-actin）鑒定VSMCs，通過SM-actin與DAPI核染之間的關系鑒定VSMCs的純度[11]。取第4～7代細胞用于后續實驗，細胞加干預因素時用含2.5%FBS的培養基。實驗分為2部分，第1部分用以驗證YWPC對VSMCs中MMP-2/9表達和活性的影響，將細胞分為對照組、Hcy組、YWPC1mg/L組、YWPC 10mg/L組及YWPC 100mg/L組，除對照組外所有細胞先用500 μmol/L Hcy干預12h，再用不同濃度的YWPC干預VSMCs。第2部分實驗用以驗證YWPC抑制VSMCs中MMP-2/9表達和活性的機制，VSMCs分為對照組、IGF-1（3ng/ml）組、YWPC（10mg/L）組和YWPC+IGF-1組。

1.2.2 Western blot測定 VSMCs中 MMP-2/9、AKT/ pAKT的表達 在用不同濃度的YWPC干預48h之后，裂解VSMCs提取蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE膠每孔加入20μl樣品，80V 30min進行蛋白濃聚，120V 2h進行凝膠電泳，并用孔徑0.45μm硝酸纖維素膜250mA 90min進行轉膜。轉膜完畢經常溫下TBST洗膜×3、脫脂奶粉封閉2h后，以1∶1 000濃度加入兔抗鼠MMP-2一抗（或抗MMP-9、AKT/pAKT一抗），4℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜×3，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育后ECL化學發光法檢測目標蛋白。暗室柯達膠片顯影，Quantity one軟件定量分析。

1.2.3 明膠酶譜法測定VSMCs中MMP-2/9的活性取20μl各組蛋白樣品在含1μg/ml明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠片上電泳,待溴酚藍到達凝膠底部，在室溫下用含2.5%Triton X-100洗滌緩沖液平搖洗滌30min× 2；37℃搖床平搖孵育緩沖液（pH8.8，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2）。然后凝膠染色2 h（含0.1%考馬斯亮藍R-250溶液，10%冰乙酸，45%甲醇溶液，45%去離子水），脫色（10%冰乙酸，45%甲醇溶液，去離子水45%）直到藍色背景下出現白色條帶，即為MMP-2/9，用雙蒸水沖洗終止脫色，用凝膠成像系統進行拍照，用Quantity One軟件定量分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。

2 結果

2.1 VSMCs原代培養及鑒定結果 用組織貼塊法培養大鼠胸主動脈VSMCs，8d左右組織塊周圍有細胞爬出，2周后細胞融合可以傳代。傳代后細胞呈典型“峰谷”狀排列生長，用SM-actin細胞免疫熒光鑒定VSMCs，DAPI核染之后確定細胞純度在99%以上，見圖1。

圖1 大鼠主動脈VSMCs形態學及細胞免疫熒光鑒定結果（A：VSMCs呈典型的“峰谷”樣生長，×100；B：免疫熒光結果顯示SM-actin在細胞中高表達，×400）。

2.2 兩種方法檢測各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達 見圖2、3，表1、2。

由圖2、3，表1、2可見，與對照組比較，Hcy組VSMCs中 MMP-2/9的表達均升高（均 P＜0.05）。Western blot法中，與Hcy組比較，YWPC不同濃度組VSMCs中MMP-2的表達均減少（P＜0.05或0.01），YWPC 10mg/L組、YWPC 100mg/L組VSMCs中MMP-9的表達均減少（P＜0.05或0.01）；明膠酶譜法中，與Hcy組比較，YWPC不同濃度組VSMCs中MMP-9的表達均減少（P＜0.05或0.01），YWPC 10mg/L組、YWPC 100mg/L組VSMCs中MMP-2的表達均減少（P＜0.05或0.01）。各組VSMCs中AKT的表達差異無統計學意義（P＞0.05），與對照組比較，Hcy組VSMCs中pAKT的表達升高（P＜0.05）；與Hcy比較，YWPC各濃度組VSMCs中pAKT的表達均減少（P＜0.05或0.01）。

圖2 Western blot法檢測各組VSMCs中MMP-2/9及AKT和pAKT的表達電泳圖

表1 Western blot法檢測各組VSMCs中MMP-2/9及AKT和pAKT的表達

圖3 明膠酶譜法檢測各組MMP-2/9的表達電泳圖

表2 明膠酶譜法檢測各組VSMCs中MMP-2/9的表達

2.3 兩種方法檢測IGF-1預處理后各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達 見圖4、5，表3、4。

圖4 Western blot檢測各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達電泳圖

表3 Western blot檢測各組VSMCs中MMP-2/9及AKT、pAKT的表達

圖5 明膠酶譜法檢測各組MMP-2/9及AKT、pAKT的表達電泳圖

表4 明膠酶譜法檢測各組MMP-2/9的表達

由圖4、5，表3、4可見，與對照組比較，YWPC組VSMCs中MMP-2/9的表達均降低（均P＜0.05）；與YWPC組比較，YWPC+IGF-1組中MMP-2/9的表達均增加（均P＜0.05）。各組VSMCs中AKT的表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，YWPC組VSMCs中pAKT的表達降低（P＜0.05）；與YWPC組比較，YWPC+ IGF-1組VSMCs中pAKT的表達增加（P＜0.05）。

3 討論

紅酒多酚由白藜蘆醇、兒茶素、花青素等組成，通過調節血脂、改善血管功能、抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移等作用而發揮心血管保護作用。我們過去的實驗已經證明YWPC具有抑制LDL受體基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的作用，然而其抑制小鼠動脈粥樣硬化的具體機制尚未闡明[12]。在本實驗中，我們證實了YWPC可以通過抑制PIK/AKT通路來抑制Hcy誘導的VSMCs中MMP-2/9的表達和活性，這可能是其具有抗動脈粥樣硬化作用的機制之一。

MMPs的過度分泌和激活可以導致粥樣斑塊的纖維帽降解破裂、增加局部的炎癥反應[13]。最近的研究還發現MMPs除了降解細胞外基質的作用之外，還可以通過降解細胞間黏附分子、誘導細胞分泌生長因子、激活其他的MMPs等路徑調節細胞內信號，從而在血管重構的發生、發展中發揮重要的作用[13]。自從Oak等[14]發現紅酒多酚主要通過降低MMP-2的表達和活性從而發揮抑制VSMCs增殖和遷移的作用，后續研究基本證實抑制MMP-2/9的表達和活性是紅酒多酚抗動脈粥樣硬化的主要機制之一[15]。我們的實驗結果證明YWPC不僅可以抑制VSMCs中MMP-2/9的表達，還可以抑制MMP-2/9的活性。這可能是黃酒發揮抗動脈粥樣硬化作用的機制之一。

PIk/AKT通路在VSMCs增殖和遷移以及表型轉化中發揮著重要作用[16]，pAKT可以進一步激活mTOR/ P70S6K通路，增加p-P70S6K1的表達，最終增加VSMCs的增殖和遷移[17]。本研究表明YWPC可以抑制PI3K/ AKT通路，減少pAKT的表達。以上結果提示YWPC可能是經PI3K/AKT通路抑制VSMCs中MMP-2的表達和活性。IGF-1是PI3K的激動劑，可以激活PI3K，增加pAKT的表達，在本實驗中，在加入IGF-1（3ng/ml）之后，YWPC抑制VSMCs中MMP-2/9的表達和活性的作用被逆轉。以上結果證實YWPC是經PI3K/AKT通路抑制VSMCs中MMP-2/9的表達和活性。

本實驗也存在一定的局限性，黃酒中的多酚類物質是由不同的單體成分組成的混合物，究竟是其中的何種確切成分在發揮作用我們尚不清楚。

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Yellow wine polyphenol compounds inhibit homocysteine-induced expression of MMP-2/9 in vascular smooth muscle cells through inhibiting PI3K/AKT pathway

LIU Longbin,MENG Liping,JI Zheng,et al.Department of Cardiology,Shaoxing People's Hospital, Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effect ofyellow wine polyphenolcompounds(YWPC)on expression ofMMP-2/9 in rat aortic vascular smooth muscle cells(VSMCs)induced by homocysteine(Hcy)and its mechanism. Methods The primarily cultured VSMCs were incubated with 500μmol/L Hcy for 12h;then VSMCs were treated with YWPCs in concentration of 1mg/L, 10mg/L or 100mg/L,respectively.IGF-1(3ng/ml)was used to activate PI3K/AKT pathway.The expressions of MMP-2,MMP-9, AKT,pAKT in VSMCs were detected with Western blotting;the activity of MMP-2/9 was examined with gelatin zymography. Results Western blotting showed that compared with Hcy group,the expressions of MMP-2/9,pAKT in YWPC groups were decreased.Gelatin zymography demonstrated that compared with Hcy group,the activity of MMP-2/9 was decreased in the YWPC groups.Compared with control group,the expressions of pAKT,MMP-2/9 was increased in the IGF-1 group(P＜0.01). Compared with YWPC groups the expression of pAKT,MMP-2/9 was increased in YWPC+IGF-1 group(P＜0.01). Conclusion YWPC inhibits Hcy-induced expression ofMMP-2/9 in VSMCs by suppressing PI3K/AKTsignaling pathway.

Vascular smooth muscle cells Yellow wne polyphenolPI3K/AKT Matrix Metalloproteinase

2012-12-17）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省自然科學基金項目（LY14H020002）

312000 紹興市人民醫院心內科

郭航遠，E-mail：ghangyuan@hotmail.com