Parkin基因甲基化對鼻咽癌早期診斷及預(yù)后判斷的價值研究

江波 倪海峰 周珍 李勇 黃光武

●基礎(chǔ)研究

Parkin基因甲基化對鼻咽癌早期診斷及預(yù)后判斷的價值研究

江波 倪海峰 周珍 李勇 黃光武

目的 研究Parkin基因甲基化在鼻咽癌早期診斷及預(yù)后判斷中的價值。方法 運(yùn)用甲基化特異性PCR檢測54例鼻咽癌組織、16例慢性鼻咽炎癥組織和16例正常鼻咽上皮組織中Parkin基因啟動子區(qū)甲基化情況，并分析其與鼻咽癌臨床生物學(xué)因素的關(guān)系。結(jié)果 慢性鼻咽炎癥組織和正常鼻咽上皮組織中均未檢測到Parkin基因甲基化，而在鼻咽癌組織中甲基化率為62.96% (34/54)，3種鼻咽組織Parkin基因甲基化情況比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。進(jìn)一步統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織Parkin基因甲基化與其臨床生物學(xué)因素均無關(guān)（均P＞0.05）。結(jié)論 Parkin基因甲基化具有腫瘤特異性，與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為早期分子生物學(xué)輔助診斷的標(biāo)志物，但不能作為判斷鼻咽癌預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

Parkin 鼻咽癌 甲基化

近年研究發(fā)現(xiàn)Parkin基因與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，Parkin基因在腫瘤中主要表現(xiàn)為基因突變或雜合性缺失[1-3]。雖然有關(guān)腫瘤組織中Parkin基因甲基化的報道少見，但已有研究在急性淋巴細(xì)胞性及慢性粒細(xì)胞性白血病中發(fā)現(xiàn)Parkin基因甲基化[4]。基于此，本研究通過檢測鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織和正常鼻咽上皮組織中Parkin基因啟動子區(qū)甲基化情況，分析Parkin基因甲基化與鼻咽癌臨床生物學(xué)因素的關(guān)系，探討其在鼻咽癌早期診斷及預(yù)后判斷中的價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008至2011年杭州市第一人民醫(yī)院和廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的經(jīng)病理學(xué)檢查確診為鼻咽癌患者54例[男39例，女15例；年齡20～78（中位數(shù)45.8）歲]、慢性鼻咽炎癥患者16例[男10例，女6例；年齡22～66（中位數(shù)40.8）歲]及正常鼻咽上皮患者16例[男11例，女5例；年齡18～68（中位數(shù)42.5）歲；均為行鼻竇內(nèi)鏡手術(shù)及扁桃體切除術(shù)患者]。3組患者性別、年齡比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。分別留取每例患者的組織標(biāo)本，即鼻咽癌組織54例、慢性鼻咽炎癥組織16例、正常鼻咽上皮組織16例。另取1例健康青年人外周血淋巴細(xì)胞作甲基化和非甲基化特異性PCR陽性對照標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用經(jīng)典的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀的方法，分別從鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織、正常鼻咽上皮組織及外周血淋巴細(xì)胞中提取DNA，用紫外分光光度儀測 A260、A280，計算濃度及A260/ A280比值。

1.2.2 DNA的CpG甲基化酶修飾 取1μg外周血淋巴細(xì)胞DNA、0.1μl 200×S-腺苷甲硫氨酸、1U的CpG甲基化酶（新英格蘭BioLabs公司）、2μl 10×反應(yīng)緩沖液，加水至20μl,37℃溫育1h；再進(jìn)行下一步DNA的亞硫酸氫鹽修飾，作為甲基化的陽性對照模板。

1.2.3 DNA的亞硫酸氫鹽修飾 將鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織、正常鼻咽上皮組織及外周血淋巴細(xì)胞中提取的DNA及經(jīng)CpG甲基化酶修飾的DNA分別作亞硫酸氫鹽修飾，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[5]。外周血淋巴細(xì)胞中提取DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后用于非甲基化陽性對照模板（所需試劑低熔點(diǎn)瓊脂糖、礦物油、Hydroquinone、Sodium metabisulphite等均購自美國Sigma公司）。

1.2.4 甲基化特異性PCR Parkin基因甲基化特異性及非甲基化PCR引物序列見表1。甲基化特異性PCR程序：95℃預(yù)變性3min，94℃30s、63℃20s、72℃20s 37個循環(huán)，最后延伸72℃5min。非甲基化特異性PCR程序：95℃預(yù)變性3min，94℃ 30s、61℃ 20s、72℃ 20s 37個循環(huán)，最后延伸72℃5min。2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，去離子水作空白對照。陽性（甲基化）標(biāo)本：僅有甲基化引物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，或甲基化和非甲基化引物均有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。陰性（非甲基化）標(biāo)本：僅有非甲基化引物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 Parkin基因甲基化及非甲基化特異性PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3種鼻咽組織Parkin基因甲基化情況比較 在慢性鼻咽炎癥組織和正常鼻咽上皮組織中均未檢測到Parkin基因甲基化，而在鼻咽癌組織中甲基化率為62.96%（34/54），3種鼻咽組織Parkin基因甲基化情況比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。3種鼻咽組織Parkin基因甲基化特異性PCR檢測電泳圖見圖1。

圖1 3種鼻咽組織Parkin基因甲基化特異性PCR檢測電泳圖（M：甲基化特異性PCR；U：非甲基化特異性PCR；MK：Marker；T1、T2、T3：鼻咽癌組織；N1、N2：慢性鼻咽炎癥組織；N3：正常鼻咽上皮組織；PC：陽性對照；H2O：陰性對照）

2.2 鼻咽癌組織Parkin基因甲基化情況與臨床生物學(xué)因素的關(guān)系 見表2。

表2 鼻咽癌組織Parkin基因甲基化情況與臨床生物學(xué)因素的關(guān)系[例（%）]

由表2可見，鼻咽癌組織Parkin基因甲基化情況與癌組織有無咽旁浸潤、有無顱內(nèi)轉(zhuǎn)移、T分期、N分期、TNM分期、病理類型等臨床生物學(xué)因素均無關(guān)（均P＞0.05）。

3 討論

鼻咽癌惡性度高，發(fā)病部位隱蔽，早期癥狀不明顯，因而早期診斷困難，嚴(yán)重影響其治療效果和預(yù)后。在過去20年里，我國鼻咽癌發(fā)病率及病死率幾乎無明顯改善，按現(xiàn)有設(shè)備、技術(shù)，如果每例鼻咽癌患者的臨床分期能降低一期，則總的5年生存率可以提高20%，因此篩選和鑒定鼻咽癌早期診斷和預(yù)后判斷的特異性分子生物學(xué)標(biāo)志物意義重大。腫瘤相關(guān)基因甲基化是腫瘤發(fā)生的早期敏感指標(biāo)，被認(rèn)為是最有前景的腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物。甲基化的DNA檢測應(yīng)用于腫瘤早期診斷，其前提條件是發(fā)現(xiàn)和鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的甲基化基因。盡管基因甲基化與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，而目前報道甲基化的鼻咽癌相關(guān)基因還為數(shù)不多。

Parkin基因最初被發(fā)現(xiàn)是遺傳性少年型帕金森病的致病基因。Parkin蛋白在帕金森病中主要作用機(jī)制是作為一種E3類泛素蛋白連接酶參與蛋白質(zhì)的泛素化過程。近年研究又發(fā)現(xiàn)Parkin基因與大腸癌[1]、肺癌[2-3]、白血病[4]、肝癌[6]、腎癌[7]、乳腺癌[8]、胰腺癌[9]、卵巢癌[10]、膠質(zhì)細(xì)胞瘤[11]等多種腫瘤有關(guān)，因此Parkin基因被認(rèn)為是一種新的腫瘤候選抑癌基因，但其在腫瘤中的作用并不僅限于參與蛋白質(zhì)的泛素化過程。

Fujiwara等[6]研究發(fā)現(xiàn)肝癌中Parkin基因不是通過激活泛素連接酶促進(jìn)蛋白體降解起作用，而是通過激活β連環(huán)蛋白促進(jìn)卵泡抑素表達(dá)，加速肝細(xì)胞增殖。Wang等[12]報道Parkin基因通過與微管細(xì)胞骨架相互作用增加乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞多核化和凋亡的敏感性，Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn)Parkin基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，其缺陷可引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。Gong等[14]和Lee等[15]分別發(fā)現(xiàn)Parkin基因作為一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的穩(wěn)定性，引起細(xì)胞周期阻滯于G1/S期和G2/M期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

本研究結(jié)果顯示，在3種鼻咽組織中，Parkin基因甲基化只發(fā)生在鼻咽癌組織，具有腫瘤特異性，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)其甲基化情況與鼻咽癌有無咽旁浸潤、有無顱內(nèi)轉(zhuǎn)移、T分期、N分期、TNM分期、病理類型等臨床生物學(xué)因素均無關(guān)。這提示Parkin基因甲基化可能在鼻咽細(xì)胞的癌變過程早期即發(fā)生，參與了鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的全過程，有望成為早期分子生物學(xué)診斷的標(biāo)志物，然而將其推廣應(yīng)用還需要進(jìn)行大樣本、隨機(jī)、前瞻性的臨床研究支持。

綜上所述，Parkin基因甲基化參與鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展全過程，且具有腫瘤特異性，有助于鼻咽癌的早期診斷，但不能作為判斷鼻咽癌臨床預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)；將Parkin基因甲基化作為鼻咽癌早期分子生物學(xué)輔助診斷的標(biāo)志物仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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Parkin genepromoter methylation in nasopharyngeal carcinoma

JIANG Bo, NIHaifeng, ZHOU Zhen, etal. Departmentof Otolaryngology,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou 310006,China

【 Abstract】 Objective To investigate Parkin gene promoter methylation in nasopharyngeal carcinoma(NPC). Methods The methylation-specific PCR(MSP)was used to detect methylation level of Parkin gene in 54 tissue specimens of NPC,16 specimens of chronic nasopharyngitis and 16 specimens of normal nasopharyngeal epithelia tissues,and its relationship with the clinical and biological features of NPC was analyzed. Results Parkin gene promoter methylation was detected in 62.96%(34/54) ofNPC specimens,not in any specimens ofchronic nasopharyngitis and normal nasopharyngeal epithelia tissues(P＜0.05).Parkin gene methylation was not correlated with clinicaland biologicalvariables ofNPC(all P＞0.05). Conclusion Parkin gene promoter methylation has high specificity in distinguishing NPC from normal nasopharyngeal tissues and inflammatory nasopharyngeal disease,suggesting that it may be used for early molecular diagnosis ofNPC.

Parkin Nasopharyngealcarcinoma Methylation

2016-02-17）

（本文編輯:李媚）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般項(xiàng)目(2011KYA127)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生骨干平臺項(xiàng)目（2012RCB038）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（江波、倪海峰、周珍、李勇）；廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（黃光武）

倪海峰，E-mail:nihaifeng138@163.com