黃連素通過調節miRNA-146a促進乳腺癌細胞凋亡*

孟昭杰， 巴雅爾， 張 明， 陳 立

(1中山大學材料科學與工程學院， 廣東 廣州 510275； 2深圳市海普瑞藥業股份有限公司， 廣東 深圳 518057；3吉林大學基礎醫學院藥理系， 吉林 長春 130021； 4包頭市腫瘤醫院綜合內科， 內蒙古 包頭 014030)

?

黃連素通過調節miRNA-146a促進乳腺癌細胞凋亡*

孟昭杰1, 2, 3， 巴雅爾4， 張 明3△， 陳 立3

(1中山大學材料科學與工程學院， 廣東 廣州 510275；2深圳市海普瑞藥業股份有限公司， 廣東 深圳 518057；3吉林大學基礎醫學院藥理系， 吉林 長春 130021；4包頭市腫瘤醫院綜合內科， 內蒙古 包頭 014030)

目的： 探討黃連素對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響及其作用機制。方法：乳腺癌細胞MCF-7采用含10%小牛血清的1640培養基培養，實驗分為對照組、黃連素低劑量組、黃連素中劑量組和黃連素高劑量組。給藥處理24 h后，采用MTT法檢測各組中MCF-7細胞的存活率；Hoechst 33258染色及流式細胞技術觀察細胞的凋亡情況；采用Western blot法檢測各組MCF-7細胞中NF-κB P65磷酸化水平及促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平；RT-qPCR法檢測細胞中microRNA-146a(miRNA-146a)的水平。為進一步探討黃連素影響乳腺癌MCF-7細胞凋亡的作用機制，本實驗還檢測了轉染miRNA-146a siRNA后黃連素對促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的mRNA水平的影響。結果：MTT實驗結果顯示，與對照組相比，黃連素中、高劑量給藥組MCF-7細胞的存活率明顯降低，且呈一定的劑量依賴性(P<0.01)；Hoechst 33258染色觀察到給藥組細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染；流式細胞技術實驗結果亦顯示，黃連素給藥組MCF-7細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；Western blot實驗結果顯示，與對照組比較，黃連素給藥組的p-P65和Bcl-2表達水平明顯降低，Bax表達水平明顯升高，且呈一定的劑量依賴性(P<0.05)；RT-qPCR實驗結果顯示，與對照組比較，黃連素給藥組的miRNA-146a表達水平明顯升高，且呈一定的劑量依賴性(P<0.05)。黃連素給藥聯合轉染miRNA-146a siRNA后，與黃連素單獨給藥組相比，MCF-7細胞中Bax mRNA水平顯著下降(P<0.05)，Bcl-2 mRNA水平顯著上調(P<0.05)。結論：黃連素能夠促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡，其機制可能有部分是通過miRNA-146a抑制NF-κB P65磷酸化，最終影響凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2的表達。

黃連素； MicroRNA-146a； 乳腺癌； 細胞凋亡

乳腺癌已成為女性較為常見的惡性腫瘤之一，近年來其發生發展日趨年輕化，發病率和死亡率也逐年增高，預計到2021年將會達到百分之一[1-2]。因此，研究和開發具有高效的抗乳腺癌的藥物是我們亟待解決的問題。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長約19～22個核苷酸的內源性的非編碼小分子RNA，在細胞的生長、分化及凋亡等方面起到關鍵作用。近年來研究證實，miR-146a的表達與乳腺癌細胞的增殖、轉移、凋亡等密切相關[3-4]。研究發現，在乳腺癌細胞MCF-7中過表達miR-146a可以抑制NF-κB信號通路，從而促進細胞凋亡，降低乳腺癌細胞的轉移和侵襲能力[4]。

黃連素又名小檗堿(berberine,BBR)，是從我國傳統中藥黃連中提取的一種重要的生物堿，具有顯著的抑菌、抗炎、降糖、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性。近來研究顯示，黃連素能夠提高乳腺癌細胞MCF-7的藥物敏感性，抑制乳腺癌細胞的轉移，促進乳腺癌細胞的凋亡[5]，亦有研究顯示黃連素可抑制NF-κB的表達[6]，但其是否能以miR-146a為靶點促進乳腺癌細胞的凋亡還有待進一步研究。

材 料 和 方 法

1 細胞、試劑和儀器

MCF-7細胞系購自上海復旦細胞庫。黃連素(東北制藥廠)；RPMI-1640培養基、小牛血清和0.25%胰蛋白酶(Gibco)；噻唑蘭(MTT)(Sigma)；Annexin V-FITC流式檢測試劑盒(上海生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；抗NF-κB(P65)、p-P65、Bax、Bcl-2、GAPDH Ⅰ抗及相應的Ⅱ抗(Abcam)；miRNA-146a siRNA(上海吉瑪生物股份有限公司)；RT-qPCR試劑盒(TaKaRa)。低溫超速離心機(Thermo)；Westen blot電泳系統(Bio-Rad)；凝膠成像系統(Tanon)；相差顯微鏡(Olympus)；分析天平(Mettler Toledo)；超凈工作臺(SIEMENS)；細胞培養箱、酶標儀(Sanyo)；流式細胞儀(Beckman)。

2 方法

2.1 細胞培養及分組 MCF-7細胞采用含雙抗(100 mg/L鏈霉素和1×105U/L 青霉素)的RPMI-1640培養基加10%小牛血清培養，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，每2～3 d換液，待細胞生長至對數生長期后進行實驗，實驗分為4組，分別為對照組(control組)、黃連素低劑量(low dose,L;2.5 μmol/L)組(BBR-L組)、黃連素中劑量(medium dose,M;5 μmol/L)組(BBR-M組)和黃連素高劑量(high dose,H;10 μmol/L)組(BBR-H組)，給藥處理24 h后收集細胞。

2.2 MTT實驗檢測細胞活力 將MCF-7細胞接種于96孔板中，每孔5×103個，細胞貼壁后給予黃連素處理24 h，每孔加入5 g/L MTT溶液，置于細胞培養箱中繼續孵育2～4 h。孵育結束后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO,置于酶標儀(490 nm)讀取吸光度(A)值。細胞存活率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2.3 Hoechst 33258染色 將MCF-7細胞接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，每孔2×105個，細胞貼壁后給予黃連素處理24 h， PBS洗滌細胞 1 min、3次，每孔加入中性多聚甲醛，室溫下固定15 min， PBS洗滌1 min、3次，之后加入500 μL Hoechst 33258染色液(5 mg/L)避光染色10 min，PBS洗滌1 min、3次，之后取出蓋玻片倒扣于滴加了抗熒光淬滅劑的載玻片上，封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.4 流式細胞術檢測MCF-7細胞凋亡情況 MCF-7細胞培養24 h后，換含不同劑量黃連素的血清及對照血清繼續培養24 h，胰酶消化，收集培養液；1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清；加入1 mL PBS重懸細胞，輕輕振蕩使細胞懸浮，300目尼龍網過濾細胞；離心，棄上清；按Annexin V細胞凋亡試劑盒步驟操作，同時以不加Annexin V-FITC及PI的MCF-7細胞作為陰性對照。

2.5 Western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達 提取細胞總蛋白，用BCA蛋白濃度試劑盒測定樣品蛋白含量，配制5%濃縮膠和15%分離膠，上樣，電泳，之后將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，并于5%脫脂奶粉或5% 牛血清白蛋白封閉液中室溫下封閉2 h，洗膜，加 I 抗Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、p-P65(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)，室溫孵育2 h，洗膜，加Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，洗膜，采用ECL化學發光法顯色，使用Quantity One軟件對結果進行處理分析。

2.6 mRNA水平檢測 不同劑量黃連素對MCF-7細胞miR-146a影響的檢測：MCF-7細胞使用不同劑量BBR處理24 h后提取RNA;轉染miR-146a siRNA后相關mRNA檢測：細胞以每孔2×104個接種于24孔板，轉染6 h后去除轉染試劑，給予5 μmol/L黃連素處理24 h，采用TRIzol法抽提MCF-7細胞總RNA,并按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。miR-146a的上游引物為5’-CCGATGTGTATCCTCAGC-TTTG-3’,下游引物為5’-GCTGAAGAACTGAATTT-CAGAGGTC-3’;U6的上游引物為5’-CTCGCTTCGGC-AGCACATA-3’,下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTGCG-3’;Bcl-2的上游引物為5’-GGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGA-3’，下游引物為5’-TGCACA-GCGGGCATTGGGTT-3’;Bax的上游引物為5’-CA-GGGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3’,下游引物為5’-CGGGGGGAGTCCGTGTCCACGTCAG-3’。擴增條件為：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min,40個循環；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s。檢測結果以2-ΔΔCt法計算，并將對照組的表達水平歸化為1后計算相對表達水平。

2.7 miR-146a siRNA轉染效率檢測 將對數期的MCF-7細胞接種于6孔板中，采用無雙抗培養基培養。24 h后按照Lipo2000轉染說明，采用瞬時轉染法將1 μg miR-146a siRNA和陰性對照siRNA轉染至乳腺癌細胞MCF-7中，轉染6 h后去除轉染試劑，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

3 統計學處理

使用SPSS 17.0軟件進行數據統計。計量資料均以均數±標準誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 黃連素對MCF-7細胞存活率的影響

MTT實驗結果如圖1所示，BBR-L組的細胞存活率與control組比較未有顯著性差異，而BBR-M和BBR-H組的細胞存活率與control組相比則顯著降低(P<0.01)。

2 黃連素對MCF-7細胞細胞核的影響

Hoechst 33258染色實驗結果可見，control組細胞的細胞核邊緣光滑整齊，呈藍色，均勻淡染；BBR給藥組細胞的細胞核固縮，邊緣不整齊，呈碎塊狀致密濃染，甚至可見裂解的細胞核；隨給藥濃度的增大，細胞核改變更為明顯，見圖2。

Figure 1.The viability of the MCF-7 cells in each group. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖1 黃連素對MCF-7細胞存活率的影響

Figure 2.The effect of berberine on the morphological changes of the nucleus in the MCF-7 cells (×400).

圖2 黃連素對MCF-7細胞細胞核形態的影響

3 黃連素對MCF-7細胞凋亡的影響

采用流式細胞技術檢測結果顯示， BBR-L組的細胞凋亡率為(9.15±1.31)%，與control組比較無顯著性差異；BBR-M和BBR-H組細胞凋亡率分別為(15.77±1.20)%和(22.37±0.89)%，與對照組相比均顯著升高(P<0.05),見圖3。

4 黃連素對MCF-7相關蛋白表達的影響

與control組相比，黃連素給藥組p-P65和Bcl-2表達水平降低，且呈一定的劑量依賴性。BBR-M和BBR-H組p-P65的表達與control組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。與control組相比，黃連素給藥后促凋亡蛋白Bax蛋白表達水平升高，且呈一定的劑量依賴性。BBR-M和BBR-H組Bax蛋白表達水平與control組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The effect of berberine on apoptosis in the MCF-7 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3 黃連素對MCF-7細胞凋亡的影響

5 黃連素對MCF-7細胞miR-146a表達水平的影響

與control組相比，黃連素給藥后miRNA-146a的表達水平升高，呈一定的劑量依賴性。BBR-M組和BBR-H組的miRNA-146a表達水平與control組相比差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

6 MCF-7細胞中miR-146a siRNA轉染效率的檢測

采用瞬時轉染法轉染miR-146a siRNA于MCF-7細胞24 h后在熒光顯微鏡下觀察miR-146a siRNA的轉染效率，約有60%以上的細胞表達綠色熒光蛋白。與此同時，RT-qPCR實驗結果也顯示轉染miR-146a siRNA 24 h后，MCF-7細胞中miR-146a的表達明顯降低，說明可用于后續實驗,見圖6。

7 黃連素通過miR-146a調控對凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的mRNA水平的影響

與control組相比，轉染miRNA-146a siRNA后24 h，MCF-7細胞中促凋亡蛋白Bax的mRNA表達水平明顯降低，抑凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表達水平明顯升高；與BBR組相比，miRNA-146a siRNA與黃連素聯合應用后，大大削弱了黃連素促進MCF-7細胞凋亡的效應，Bax的mRNA表達水平明顯降低，抑凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表達水平明顯升高。說明黃連素能夠促進乳腺癌細胞MCF-7的凋亡，至少部分是通過miRNA-146a實現的，見圖7。

Figure 4.The effect of berberine on the protein expression of Bax, Bcl-2 and p-P65 in the MCF-7 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4 黃連素對MCF-7細胞Bax、Bcl-2和p-P65蛋白表達的影響

Figure 5.The effect of berberine on the expression of miRNA-146a in the MCF-7 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 黃連素對MCF-7細胞miRNA-146a表達的影響

討 論

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，是全世界排名第二的腫瘤疾病，每年有近50萬女性患者死于乳腺癌[7]。諸多因素參與了乳腺癌的形成、發展及轉移，microRNA 是其重要的影響因素之一，并且可能用于乳腺癌的早期診斷[8]。miR-155和miR-21是具有促癌作用的microRNA。Zhang 等[9]證實，miR-155可直接與腫瘤蛋白53誘導核蛋白1(Tp53INP1，一種抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的蛋白)3’-UTR區結合，使Tp53INP1表達減少，從而抑制癌細胞分化周期G1期的停滯，促進癌細胞增殖。

Figure 6.The efficiency of miR-146a siRNA transfection detected by RT-qPCR. siRNA: miR-146 siRNA. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖6 MCF-7細胞中miR-146a siRNA轉染效率的檢測

Figure 7.The effect of berberine and know-down of miR-146a on the mRNA expression of Bax and Bcl-2. siRNA: miR-146a siRNA. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsBBR group.

圖7 黃連素通過miR-146a調節凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 mRNA的表達水平

Li 等[10]發現，轉移率高的乳腺癌中miR-21 的表達明顯高于轉移率低的乳腺癌。近年來研究證實，miRNA-146a是一個典型的多功能microRNA，參與炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤等的發生發展。Kumar等[11]證實，與健康志愿者相比，乳腺癌患者血清中miR-146a水平顯著升高，這一點可以用作乳腺癌的診斷指標。但乳腺癌患者血清中高水平的miR-146a是如何產生并進一步影響乳腺癌病程的發生和發展目前尚沒有報道。另有大量研究報道，NF-κB是miR-146a的靶蛋白[12]，miR-146a通過調節NF-κB的表達對炎癥、免疫疾病、糖脂代謝異常及腫瘤等疾病進行調節。

近年來，黃連素作為傳統的治療腹瀉藥物，被廣泛地證明具有抗炎、降糖、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性。黃連素抑制乳腺癌增殖作用亦被廣泛報道。Li等[13]研究表明，黃連素可以下調乳腺癌MDA-MA-231細胞中NF-κB的表達，從而抑制乳腺癌細胞的增殖；Pazhang等[6]證實，黃連素可以通過調節NF-κB的表達，進而影響環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的表達，達到促進人乳腺導管上皮腫瘤細胞凋亡的作用。然而，黃連素在乳腺癌細胞中是否對miR-146a具有調節作用，以及更進一步通過miR-146a調節NF-κB誘導乳腺癌細胞凋亡目前尚無報道。本實驗結果顯示黃連素處理細胞后，MCF-7細胞凋亡率顯著增加，Bax表達明顯升高、Bcl-2表達水平明顯降低，呈劑量依賴性，且p-P65的表達水平隨黃連素濃度的增加而降低，miRNA-146a表達水平明顯增加。本實驗研究也顯示將miRNA-146a 沉默后，黃連素促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡的水平明顯降低。說明黃連素能夠促進乳腺癌細胞的凋亡至少部分是通過miR-146a實現的。

[1] Levaggi A, Poggio F, Lambertini M. The burden of breast cancer from China to Italy[J]. J Thorac Dis, 2014, 6(6):591-594.

[2] Fan L, Strasser-Weippl K, Li JJ, et al. Breast cancer in China[J]. Lancet Oncol, 2014, 15(7):e279-e289.

[3] Liu Q, Wang W, Yang X, et al. MicroRNA-146a inhibits cell migration and invasion by targeting RhoA in breast cancer[J]. Oncol Rep, 2016, 36(1):189-196.

[4] Bhaumik D, Scott GK, Schokrpur S, et al. Expression of microRNA-146 suppresses NF-kappaB activity with reduction of metastatic potential in breast cancer cells[J]. Oncogene, 2008, 27(42):5643-5647.

[5] Barzegar E, Fouladdel S, Movahhed TK, et al. Effects of berberine on proliferation, cell cycle distribution and apoptosis of human breast cancer T47D and MCF7 cell lines[J]. Iran J Basic Med Sci, 2015, 18(4):334-342.

[6] Pazhang Y, Ahmadian S, Javadifar N, et al. COX-2 and survivin reduction may play a role in berberine-induced apoptosis in human ductal breast epithelial tumor cell line[J]. Tumour Biol, 2012, 33(1):207-214.

[7] 彭曉丹, 諸夢露, 高綠芬, 等. FK228和雷帕霉素協同促進人乳腺癌細胞凋亡和細胞周期阻滯[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(4):577-584.

[8] 霍 晶, 吳夏陽, 李文睿, 等. MicroRNA與乳腺癌近期研究進展[J]. 中國臨床藥理學雜志, 2015, 31(16):1677-1680.

[9] Zhang CM, Zhao J, Deng HY. MiR-155 promotes proliferation of human breast cancer MCF-7 cells through targeting tumor protein 53-induced nuclear protein 1[J]. J Biomed Sci, 2013, 20:79.

[10]Li J, Zhang Y, Zhang W, et al. Genetic heterogeneity of breast cancer metastasis may be related to miR-21 regulation of TIMP-3 in translation[J]. Int J Surg Oncol, 2013, 2013:875078.

[11]Kumar S, Keerthana R, Pazhanimuthu A, et al. Overexpression of circulating miRNA-21 and miRNA-146a in plasma samples of breast cancer patients[J]. Indian J Biochem Biophys, 2013, 50(3):210-214.

[12]Kamali K, Korjan ES, Eftekhar E, et al. The role of miR-146a on NF-kappaB expression level in human umbilical vein endothelial cells under hyperglycemic condition[J]. Bratisl Lek Listy, 2016, 117(7):376-380.

[13]Li X, Zhao SJ, Shi HL, et al. Berberine hydrochloride IL-8 dependently inhibits invasion and IL-8-independently promotes cell apoptosis in MDA-MB-231 cells[J]. Oncol Rep, 2014, 32(6):2777-2788.

(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

Berberine promotes apoptosis of human breast cancer cells by regulating miRNA-146a

MENG Zhao-jie1, 2, 3, BA Ya-er4, ZHANG Ming3, CHEN Li3

(1SchoolofMaterialsScienceandEngineering,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China;2ShenzhenHepalinkPharmaceuticalCo.,Ltd,Shenzhen518057,China;3DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedicalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China;4ComprehensiveMedicineDepartment,BaotouCancerHospital,Baotou014030,China.E-mail:zhangming_00@126.com)

AIM: To observe the effect of berberine on apoptosis of MCF-7 cells and its potential mechanism. METHODS: The MCF-7 cells were divided into control group and the groups with 3 different doses of berberine. The cell viability was detected by MTT assay, while the cell apoptosis was measured by Hoechst 33258 staining and flow cytometry assay. The protein levels of p-P65, Bax and Bcl-2 were Western blot. The levels of microRNA-146a(miRNA-146a) in the MCF-7 cells were detected by RT-qPCR. The miRNA-146a siRNA was transfected to the MCF-7 cells after an evaluation of transfection efficacy, which was co-incubated with berberine to observe its effects on the mRNA levels of Bax and Bcl-2. RESULTS: Compared with control group, the cell viabilities were decreased significantly in medium and high doses of berberine treatment groups with a dose-dependent manner (P<0.01). The cell apoptosis was increased significantly in medium and high doses of berberine treatment groups dose-dependently (P<0.05). The protein levels of Bax were up-regulated, while those of Bcl-2 and p-P65 were down-regulated significantly by the treatment of berberine (P<0.05). In addition, the miRNA-146a levels were increased significantly in medium and high doses of berberine treatment groups (P<0.05) and showed a dose-dependent manner. The mRNA levels of Bax were decreased, while the mRNA levels of Bcl-2 were increased after transfection with miRNA-146a siRNA and co-incubated with berberine. CONCLUSION: Berberine promotes apoptosis of MCF-7 cells. The mechanism may be related to inhibit the activity of NF-κB by incresing the levels of miRNA-146a.

Berberine; MicroRNA-146a; Breast cancer; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 1966- 06

2016- 09- 09

2016- 10- 13

吉林省科委基金(No. 20140203011YY; No. 20150311013YY)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.008

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0431-85619799; E-mail: zhangming_00@126.com