miR-497與腎癌預后的關系及其對腎癌786-0細胞增殖、凋亡和侵襲的影響

張旖驍， 吳 斌

(中國醫科大學附屬盛京醫院第一泌尿外科，遼寧 沈陽 110004)

?

miR-497與腎癌預后的關系及其對腎癌786-0細胞增殖、凋亡和侵襲的影響

張旖驍， 吳 斌△

(中國醫科大學附屬盛京醫院第一泌尿外科，遼寧 沈陽 110004)

目的： 探討微小RNA-497(miR-497)與腎癌預后的關系及其對腎癌786-0細胞增殖、凋亡和侵襲的影響。方法:收集2011年～2015年80例腎細胞癌患者手術切除的癌組織和癌旁組織并回顧性分析患者隨訪資料。采用實時定量PCR 法檢測癌組織及配對的癌旁組織中miR-497的表達。在腎癌細胞系786-0中轉染miR-497模擬物，應用MTT法、臺盼蘭拒染法活細胞計數、流式細胞術和Transwell小室實驗檢測miR-497對786-0細胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響。通過生物信息學預測miR-497在786-0細胞中作用的靶基因。Western blotting法檢測miR-497對靶基因蛋白表達影響。結果:腎癌組織中miR-497的表達量明顯低于癌旁組織(P<0.05)。786-0中miR-497表達量明顯低于正常腎上皮細胞中miR-497表達量(P<0.05)。隨訪時間2～48個月，中位隨訪時間29個月，失訪6例，隨訪率92.5%。76例患者3年無復發生存率(recurrence-free survival，RFS)為55.2%。高miR-497表達組和低miR-497表達組腎癌患者的RFS分別為71.2% 和40.1%，差異有統計學顯著性(P<0.05)。過表達miR-497可顯著抑制786-0細胞的增殖和侵襲能力，顯著促進細胞凋亡(P<0.05)。過表達miR-497可顯著抑制786-0細胞中cyclin D1蛋白的表達(P<0.05)。結論:miR-497與腎癌預后相關，miR-497能明顯抑制腎癌786-0細胞的增殖和凋亡，其機制可能與其靶向抑制cyclin D1有關。

腎細胞癌； 微小RNA-497； 細胞增殖； 預后

微小RNA(microRNA,miRNA)是存在于動植物中的一類高度保守的非編碼小分子RNA[1-2]。它們可以特異性地與靶基因mRNA的3’非翻譯區發生互補結合，影響蛋白的翻譯過程或降解靶基因mRNA，以此對靶基因產生抑制作用[3-4]。最新研究表明，miR-497表達下調與多種腫瘤預后相關[5]，有望成為腫瘤基因治療的有力工具。我們檢測腎癌組織和細胞系786-0中miR-497的表達水平，同時分析其與腎癌患者預后的關系，以針對miR-497的模擬物轉染腎癌細胞系786-0，觀察其對786-0細胞增殖、凋亡和侵襲的影響并探討其可能機制。

材 料 和 方 法

1 病例收集與實驗材料

選擇我院2011年至2015年手術切除的原發性腎細胞癌標本80例，病理檢查證實為透明細胞癌41例, 乳頭狀癌39例。其中男58例，女22例, 年齡46～75歲，平均49.7歲。采用美國腫瘤聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)標準作臨床分期：IV期21例、III期25例、II期22例、I期12例。按照世界衛生組織標準進行組織學分級：低分化20例、中分化22例、高分化38例。另取癌旁正常腎臟組織(距離癌灶組織邊2～5 cm)作為對照。患者術前均未進行化療和放療，所有樣本采集均符合醫學倫理學規定，患者均簽署知情同意書。隨訪時間2～48個月，中位隨訪時間29個月，失訪6例，隨訪率92.5%。

人腎小管上皮細胞系HK-2及人腎細胞癌細胞系786-0購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI-1640培養液購自Gibco；胎牛血清購自HyClone；TRIzol購自Invitrogen；miRNA分析系統購自Applied Biosystems；PrimeScript RT-PCR反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex-Taq 熒光定量PCR試劑盒均購自TOYOBO；miR-497模擬物及陰性對照miRNA購自上海吉瑪公司；細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；兔抗人單抗cyclin D1購自Abcam；細胞裂解液CLB購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 實時熒光定量PCR檢測人腎癌組織、癌旁組織以及786-0和HK-2中miR-497的表達 采用TRIzol試劑提取相應的人組織和細胞中總RNA。采用SYBR Premix ExTaq 熒光定量PCR試劑盒和LightCycler儀器進行操作和分析。miR-497的逆轉錄引物序列：miR-497 模似物的上游引物為5’- CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3’，下游引物為5’-AAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3’；內參照U6的上游引物為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游引物為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。反應條件為94 ℃ 15 s；94 ℃ 20 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，40次循環；72 ℃ 10 min。腎癌組織和細胞中miR-497的表達量采用2-ΔΔCt計算。

2.2 細胞培養和miR-497模擬物的轉染 人腎癌細胞系786-0和腎小管上皮細胞系HK-2分別用含10%胎牛血清的RPMI-1640和DMEM/F12培養液培養，均置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中傳代培養。將處于對數生長期的786-0細胞接種于6孔培養板，每孔細胞數約為2×105個，當細胞生長融合度至50%時，將其分為miR-497模擬物轉染(miR-497)組和陰性對照(control)組，培養液中加入INTERFERin以提高轉染效率。轉染時每孔miR-497模擬物或者對照miRNA的終濃度均為20 nmol /L，INTERFERin為4 μL，轉染48 h或72 h。實驗重復3次。2.3 MTT法檢測miR-497對786-0細胞活力的影響 786-0細胞轉染miR-497模擬物或者陰性對照miRNA 72 h 后，將轉染組和對照組細胞按照每孔細胞數量2×104個接種于96 孔培養板中，并各設置3個平行孔，3～4 h后，待細胞貼壁后加入100 μL 1640完全培養液繼續培養，1 d、2 d、3 d和4 d后分別每孔加入MTT 10 μL (5 g/L)，置37 ℃、5% CO2培養箱培養2 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜100 μL,酶標儀570 nm波長下測定吸光度(A)值。實驗重復3次。

2.4 臺盼蘭拒染法活細胞計數檢測miR-497對786-0細胞增殖的影響 786-0細胞轉染miR-497模擬物或者陰性對照miRNA 72 h 后，將轉染組和對照組細胞按照每孔細胞數量1×105個接種于6 孔培養板中，并各設置3個平行孔，3～4 h后，待細胞貼壁后加入100 μL RPMI-1640完全培養液繼續培養，1 d、2 d、3 d和4 d后胰酶消化各孔細胞并用臺盼蘭染色計數。實驗重復3次。

2.5 流式細胞術檢測miR-497對786-0細胞凋亡的影響 收集上述各組細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次，2 000 r/min離心5 min收集細胞。在50 μL的binding buffer中加入5 μL Annexin Ⅴ染液，混勻；加入5 μL 7-AAD染液至收集細胞中，室溫，避光反應5～15 min；樣品在30 min內應用流式細胞儀檢測。實驗結果應用FlowJo軟件分析細胞凋亡情況。實驗重復3 次。

2.6 Transwell小室實驗檢測miR-497對786-0細胞侵襲能力的影響 消化轉染后的細胞離心后用含有0.1%牛血清白蛋白的DMEM培養基重懸，按照5×105個細胞接種于Transwell上室中(上室鋪60 μL稀釋后的Matrigel)。在下室中，每孔加人500 μL 含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基, 并放置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h，對小室下邊細胞應用蘇木素染核，顯微鏡下拍照和計數。

2.7 生物信息學預測 利用生物信息學網站TargetScan (http://www.targetscan．org)進行生物信息學預測，分析結果顯示miR-497可能的靶分子為cyclin D1。

2.8 Western blotting法檢測miR-497對786-0細胞cyclin D1蛋白表達的影響 786-0細胞轉染72 h后，收集轉染組和對照組細胞，用細胞裂解液裂解細胞。BCA法測定蛋白濃度，取50 μg 蛋白經8% SDS-PAGE 分離后，轉至PVDF 膜，室溫封閉1 h，分別加入抗cyclin D1抗體(1∶500)、抗GAPDH抗體(1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加過氧化物酶標記的 II 抗，室溫孵育1 h，洗膜，最后用ECL法顯影。GeneGnome采集圖片并利用ImageJ軟件進行灰度值分析。實驗重復3 次。

3 統計學處理

應用SPSS 19.0軟件處理數據，隨訪數據采用Kaplan-Meier法，并繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用配對或者不配對的t檢驗分析數據，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-497在腎癌細胞系786-0及腎癌組織中的表達

實時熒光定量PCR 法檢測腎癌細胞系786-0和人腎小管上皮細胞系HK-2的相對表達量，結果顯示以HK-2為對照，786-0細胞的miR-497表達明顯降低，差異有統計學顯著性(P<0.05)。實時定量PCR 法檢測80例腎癌患者的癌組織與癌旁組織中miR-497的相對表達量，結果顯示癌組織中的miR-497表達明顯低于配對的癌旁組織，差異有統計學顯著性(P<0.05),見圖1。

Figure 1. Low expression of miR-497 in human renal cancer tissues and cell line. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHK-2;#P<0.05vsadjacent tissues.

圖1 miR-497在腎癌細胞系及腎癌組織中低表達

2 腎癌組織miR-497的表達與預后的相關性

對80例腎癌患者進行Kaplan-Meier生存曲線分析，結果顯示術后3年無復發生存率(recurrence-free survival，RFS)為55.2%，高表達miR-497組患者的3年RFS為71.2%，低表達miR-497組患者的3年RFS為40.1%，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖2。

3 過表達miR-497對786-0細胞增殖的影響

實時熒光定量PCR檢測轉染后miR-497在轉染組細胞和對照或空白組細胞表達量差異，結果顯示轉染組細胞的miR-497表達量是對照或空白組的15倍左右，差異有統計學顯著性(P<0.01)。利用MTT法檢測轉染組和對照組的細胞活力，過表達miR-497抑制786-0細胞活力。臺盼蘭拒染法活細胞計數檢測miR-497對786-0細胞增殖的影響，與對照相比，過表達miR-497抑制786-0細胞的生長，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖3。

4 過表達miR-497對786-0細胞凋亡的影響

應用流式細胞術對轉染組和對照組細胞的凋亡進行檢測。結果顯示，與對照相比，過表達miR-497的786-0細胞的凋亡比例明顯增加，差異有統計學顯著性 (P<0.05)，見圖4。

Figure 2.Low expression levels of miR-497 were associated with a poor recurrence-free survival rate compared with high expression levels of miR-497.

圖2 低表達miR-497腎癌患者無復發生存率較低

Figure 3. miR-497 inhibited the growth of 786-0 cells. A: 786-0 cells were transfected with miR-497 mimics or negative control miRNA, and then miR-497 expression levels were analyzed by RT-qPCR; B: over-expression of miR-497 induced low viability of the indicated cells detected by MTT assay; C: over-expression of miR-497 inhibited 786-0 cell proliferation at 3 d and 4 d detected by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 過表達miR-497對786-0細胞增殖的影響

Figure 4.Over-expression of miR-497 affected apoptosis of 786-0 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 過表達miR-497對786-0細胞凋亡的影響

5 過表達miR-497對786-0細胞侵襲能力的影響

應用體外Transwell小室實驗檢測轉染組和對照組細胞的侵襲能力。結果顯示與對照相比，過表達miR-497的786-0細胞的侵襲能力受到顯著抑制，差異有統計學顯著性(P<0.05)，見圖5。

6 過表達miR-497抑制cyclin D1蛋白的表達

應用Western blotting法檢測miR-497對786-0細胞cyclin D1蛋白表達的影響。結果顯示與對照組相比，過表達miR-497降低了786-0細胞中cyclin D1蛋白的表達水平，見圖6。

Figure 5.Transwell invasion assay of 786-0 cells after over-expression of miR-497. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 過表達miR-497對786-0細胞侵襲能力的影響

討 論

miRNA能與多種靶基因結合，具有可預測性的特點。越來越多的文獻表明，miRNA可以作為一項工具來調控與腫瘤發生發展有關的信號通道和一些關鍵基因或因子，并將與腫瘤有關的這一類miRNA稱為oncomir[4-5]。目前，與腎癌相關的miRNA研究已取得了一些進展，但目前明確對腎癌發生發展具有調控作用的miRNA仍需繼續發掘。

Figure 6. The protein levels of cyclin D1 were inversely related with miR-497 levels in the 786-0 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 過表達miR-497對786-0細胞cyclin D1蛋白表達的影響

miR-497作為miRNA家族中的一員，參與了多種腫瘤的發生發展。在胃癌、胰腺癌和乳腺癌中發現miR-497表達下調，并且同腫瘤細胞增殖呈負相關[6-7]。Zhao等[5]通過芯片分析發現miR-497與腎癌預后相關。本研究發現，miR-497在腎癌細胞系786-0中表達明顯降低，提示miR-497的表達水平與腎癌的發生有顯著相關性。同時我們分析了腎癌癌組織和癌旁組織中miR-497的相對表達，發現腎癌癌組織中miR-497表達明顯下調。通過對80例腎癌患者進行隨訪，隨訪結果顯示，高表達miR-497組患者3年RFS為71.2%，低表達miR-497組患者3年RFS為40.1%，差異有統計學顯著性，此結果與之前文獻報道的結果一致[5]，提示miR-497可能參與調控腎癌的發生發展。

為進一步研究 miR-497在腎癌發生發展中的作用，我們體外構建了過表達miR-497的786-0細胞。MTT實驗、臺盼蘭拒染法活細胞計數、流式細胞術和Transwell小室實驗結果表明，與對照組的比較，轉染 miR-497模擬物的786-0細胞的細胞增殖和侵襲能力均明顯下降，而細胞凋亡明顯增加。該結果進一步提示，miR-497在腎癌發生發展中可能扮演著抑癌基因的作用。

Cyclin D包括D1、D2和D3 多個亞類，它們的基因序列及氨基酸序列的同源性較高，功能上也具有一定的重疊性，其中cyclin D1在大多數組織細胞內占主導地位，因此也相對重要[8]。該基因位于染色體11q13，長度為120 kb。Cyclin D1作為原癌基因，在調節細胞從G1期進入S期中發揮重要作用[9]。有研究顯示cyclin D1在膀胱癌中呈高表達, 癌旁組織中呈低表達，差異有統計學顯著性。上述結果提示cyclin D1在膀胱癌中的異常表達可能參與膀胱癌的發生、發展過程[10]。我們通過生物信息學預測cyclin D1可能是腎癌細胞系786-0中miR-497發揮作用的靶基因。Western blotting實驗結果發現，miR-497能顯著降低786-0細胞中cyclin D1蛋白表達，這一結果揭示miR-497可能通過靶向抑制cyclin D1從而參與調控腎癌細胞增殖和凋亡。研究表明，一個miRNA可同時影響多個基因的表達，從而調控細胞的生物學特性。由此，我們推測miRNA-497可能通過影響其它基因的表達來調控腎癌細胞侵襲能力，其具體機制還有待于深入研究。

[1] Tutar Y. miRNA and cancer; computational and experimental approaches[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2014, 15(5):429.

[2] 唐夏莉, 焦德敏, 陳 君,等. miRNA-126對肺癌A549細胞的增殖、遷移、侵襲及EGFR/AKT/mTOR信號通路的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3): 458-463.

[3] Munari E, Marchionni L, Chitre A, et al. Clear cell papillary renal cell carcinoma: micro-RNA expression profiling and comparison with clear cell renal cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma[J]. Human Pathol, 2014, 45(6):1130-1138.

[4] Bing Z, Hua Z, Donghua G, et al. MiRNA-30a-mediated autophagy inhibition sensitizes renal cell carcinoma cells to sorafenib[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 459(2):234-239.

[5] Zhao X, Zhao Z, Xu W, et al. Down-regulation of miR-497 is associated with poor prognosis in renal cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(1):758-764.

[6] Li D, Zhao Y, Liu C, et al. Analysis of miR-195 and miR-497 expression, regulation and role in breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(7):1722-1730.

[7] Xu J, Wang T, Zhe C, et al. MiR-497 downregulation contributes to the malignancy of pancreatic cancer and associates with a poor prognosis[J]. Oncotarget, 2014, 5(16):6983-6993.

[8] 燕海嬌，蔣敬庭，劉文松，等. 慢病毒介導微小RNA-20a過表達抑制胰腺癌細胞的增殖[J]. 中華實驗外科雜志，2012, 29(9):1771-1774.

[9] Hernández-Hernández OT, Camacho-Arroyo I. Regulation of gene expression by progesterone in cancer cells: effects on cyclin D1, EGFR and VEGF[J]. Mini Rev Med Chem, 2013, 13(5):635-642.

[10]Liang Z, Li S, Xu X, et al. MicroRNA-576-3p inhibits proliferation in bladder cancer cells by targeting cyclin D1[J]. Mol Cell, 2015, 38(2):130-137.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Association of miR-497 and prognosis in patients with renal cell carcinoma and its effects on proliferation, apoptosis and invasion of human renal cell carcinoma cell line 786-0

ZHANG Yi-xiao, WU Bin

(DepartmentofUrologySurgery,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China.E-mail:wub@sj-hospital.org)

AIM: To investigate the association of microRNA-497 (miR-497) and prognosis in the patients with renal cell carcinoma (RCC) and its effects on the proliferation, apoptosis and invasion of human RCC cell line 786-0. METHODS: Paired RCC and adjacent non-tumor tissue specimens were surgically collected from 80 patients who were diagnosed with primary RCC between 2011 and 2015. The expression of miR-497 in the paired RCC and adjacent non-tumor tissue specimens was detected by real-time PCR. Recurrence-free survival was estimated using the Kaplan-Meier method and compared using the log-rank test. The 786-0 cells were transfected with miR-497 mimics or scramble control miRNA. The proliferation, apoptosis and invasion abilities of the transfected cells were assessed by MTT assay, Trypan blue exclusion, flow cytometry and Transwell chamber experiment. The protein expression of miR-497-targeted gene cyclin D1 in the transfected cells was quantified by Western blotting. RESULTS: miR-497 was down-regulated in the RCC specimens compared with the adjacent tissues. miR-497 was down-regulated in the RCC 786-0 cells compared with the HK-2 cells. By the end of the study, 74 cases were followed up. The follow-up rate was 92.5%. Median follow-up was 29 months (ranging from 2 months to 48 months). The 3-year recurrence-free survival rates of the patients with high and low miR-497 expression were 71.2% and 40.1%, respectively. Over-expression of miR-497 resulted in significant suppression effect on RCC cell proliferation, invasion and the expression of cyclin D1. CONCLUSION: Low expression of miR-497 was correlated with poor prognosis in the RCC patients. miR-497 inhibits proliferation and invasion of RCC 786-0 cells and its mechanism is associated with the down-regulation of cyclin D1.

Renal cell carcinoma; MicroRNA-497; Cell proliferation; Prognosis

1000- 4718(2016)11- 1979- 05

2016- 05- 10

2016- 09- 09

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.010

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 96615-34111; E-mail： wub@sj-hospital.org