黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對PC12細胞氧糖剝奪復糖復氧后細胞自噬和PI3K信號通路的影響*

丁 煌， 李靜嫻， 楊筱倩， 唐 標， 劉曉丹， 唐映紅， 鄧常清， 黃小平

(湖南中醫藥大學分子病理實驗室，中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208)

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黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對PC12細胞氧糖剝奪復糖復氧后細胞自噬和PI3K信號通路的影響*

丁 煌， 李靜嫻， 楊筱倩， 唐 標， 劉曉丹， 唐映紅， 鄧常清， 黃小平△

(湖南中醫藥大學分子病理實驗室，中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208)

目的： 探討黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對PC12細胞氧糖剝奪后再復糖復氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)誘導的細胞自噬的影響及作用機制。方法:以PC12細胞建立OGD/R自噬性損傷模型，觀察黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對細胞自噬的影響，并通過PI3K Ⅰ/Akt/mTOR和PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號通路研究黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的作用機制。結果:氧糖剝奪2 h復糖復氧24 h后，PC12細胞內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值增加。黃芪甲苷、人參皂苷Rg1及黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍均能下調OGD/R后PC12細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值，且配伍組的效應強于藥物單用組。機制研究表明，人參皂苷Rg1單用及黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍能升高PI3K Ⅰ、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平，配伍的效應強于藥物單用；黃芪甲苷單用及黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍均能抑制PI3K Ⅲ、beclin-1蛋白表達，而配伍還能上調Bcl-2蛋白表達，且配伍的效應強于藥物單用組。結論:PC12細胞在缺糖缺氧2 h再復糖復氧24 h后，細胞出現自噬；黃芪甲苷和人參皂苷Rg1均能減輕OGD/R誘導的PC12細胞自噬，且2者配伍對細胞自噬具有協同抑制作用，其機制可能與調節PI3K Ⅰ/Akt/mTOR和PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號通路有關。

黃芪甲苷； 人參皂苷Rg1； PC12細胞； 自噬； PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號通路； PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號通路

細胞自噬是細胞受到刺激后，通過溶酶體途徑降解細胞內物質，以實現細胞本身代謝需要和某些細胞器更新的過程[1]。已有研究表明，在神經細胞氧糖剝奪后再復糖復氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模擬的腦缺血再灌注損傷模型中，缺糖缺氧可誘發自噬性損傷[2-3]。黃芪和三七是臨床治療心腦血管疾病的常用有效中藥，二者常配伍使用。我們前期研究表明，黃芪的有效成分黃芪甲苷和三七的有效成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1配伍可發揮抗缺血性腦損傷的作用，其作用可能主要來自于黃芪甲苷和人參皂苷Rg1的配伍[4]。藥物相互作用研究表明，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1對PC12細胞缺糖缺氧2 h再復糖復氧24 h引起的細胞自噬性損傷具有抑制作用，兩藥配伍對細胞自噬性損傷具有協同抑制作用，但其機制還不清楚。因此，本研究采用PC12細胞氧糖剝奪后再復糖復氧模擬細胞缺血再灌注損傷模型，研究黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對細胞自噬性損傷的作用機制，為其合理應用提供科學依據。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 胰蛋白酶、Hochest 33258(Solarbio)；DMEM高糖培養基、胎牛血清(HyClone)；無糖Earle’s培養基(Biotopped)；神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、兔抗大鼠Tyr607磷酸化Ⅰ型磷脂酰肌醇3-激酶(class Ⅰphospho-phosphoinositide 3-kinase, p-PI3K Ⅰ)抗體、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Sigma)；二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)(MP Biomedicals)；兔抗大鼠微管相關蛋白3(microtubule -associated protein 1 light chain 3，LC3) 抗體(MBL)；兔抗大鼠Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3-kinase, PI3K Ⅲ)抗體(Cell Signaling Technology)；兔抗大鼠beclin-1 抗體、兔抗大鼠Ser2481磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phospho-mammalian target of rapamycin, p-mTOR)抗體(Abcam)；兔抗大鼠B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(中國博奧森)；兔抗大鼠Tyr315/316/312磷酸化蛋白激酶B(phospho- protein kinase B, p-Akt)抗體(Santa Cruz Biotechnology)；小鼠抗大鼠β-actin抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的羊抗兔、羊抗小鼠的 II 抗(Proteintech)；熒光素四甲基異硫氰酸羅丹明(tetraethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC)標記的羊抗兔II抗(Boster)；曲拉通X-100(上海國藥集團)； ECL化學發光試劑(Tamper Evident Seal)；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)(Selleck)；雷帕霉素(rapamycin，Rapa)(Gene Operation)。

1.2 細胞株 PC12細胞是來源于大鼠的高分化、永生性腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，美國模式培養物收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)中的編號為CRL-1721，購自武漢大學中國典型培養物保存中心。

1.3 受試藥物 黃芪甲苷、人參皂苷Rg1購自中國成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%。黃芪甲苷以含0.1% DMSO的PBS溶解，人參皂苷Rg1以PBS溶解。

2 方法

2.1 PC12細胞的培養及OGD/R自噬性損傷模型的建立 根據我們以往的研究，PC12細胞在缺糖缺氧2 h再復糖復氧24 h后，細胞產生自噬性損傷，且損傷程度達高峰。因此，在本研究中，采用缺糖缺氧2 h再復糖復氧24 h制作細胞自噬性損傷模型。細胞以DMEM高糖培養基(含4.5 g/L葡萄糖、10%胎牛血清和1%青鏈霉素)于37 ℃、20% O2、75% N2、5% CO2及飽和濕度條件下培養，2 d換液1次，待細胞生長融合后傳代培養。以1×107/L密度接種于12孔或96孔培養板中，培養24 h待細胞貼壁后再加終濃度50 μg/L的NGF誘導分化48 h后[5]，棄原培養液，加入無血清培養基培養24 h，使細胞同步化于G0期。然后進行如下處理：細胞加無糖Earle’s培養液，置于三氣培養箱中(5% CO2、1% O2、94% N2)模擬缺糖缺氧培養2 h后，換成DMEM高糖培養液常規培養進行復糖復氧24 h，復制OGD/R模型。

2.2 自噬標志蛋白LC3的測定 根據我們對藥物相互作用的研究，表明在缺糖缺氧2 h再復糖復氧24 h后，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1以IC50劑量進行1∶1配伍時對細胞自噬的抑制呈協同作用，因此，我們選用該劑量進行后續實驗。 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1的IC50分別為3.45 mg/L 1.71 mg/L。實驗分為正常組、模型組、黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組、配伍組、3-MA(自噬抑制劑)組及雷帕霉素(自噬誘導劑)組。正常對照組換DMEM高糖培養液常規培養。模型組造模。3-MA終濃度為25 mmol/L[6-7]，雷帕霉素終濃度為200 nmol/L[8]。均于缺糖缺氧前30 min加入藥物，再進行缺糖缺氧和復糖復氧培養。每組重復3次。細胞處理完成后以Western blot法測定LC3蛋白表達。操作步驟簡述如下：吸去培養上清液，PBS洗滌，刮下細胞，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，加入100 μL蛋白裂解液和1 μL蛋白酶抑制劑，充分混勻后冰上靜置20 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA試劑盒測定總蛋白含量；取30 μg蛋白100 ℃水浴10 min變性后，120 V恒壓電泳70 min后，200 mA轉膜2 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別與兔抗大鼠LC3的I 抗(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin的I 抗(1∶1 000)混合，4 ℃靜置過夜，TBS洗3次后TBST洗1次，然后分別加羊抗兔 II 抗(1∶2 000)或羊抗小鼠 II抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBS洗3次后TBST洗1次，暗室中加ECL化學發光劑顯影；Image Pro-Plug 6.0圖像分析軟件測定目的條帶的累積吸光度(IA)值，以目的條帶的IA與β-actin條帶的IA的比值作為該目的蛋白的相對表達量。自噬發生后，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ，分子量為18 kD)會酶解切掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型LC3(即LC3-Ⅱ，分子量為16 kD)，通過Western blot法可以分別檢測到這2個蛋白質，計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以反映自噬的程度。

2.3 PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的測定 實驗分為正常組、模型組、黃芪甲苷組，人參皂苷Rg1組、配伍組和雷帕霉素(mTOR抑制劑)+黃芪甲苷組、雷帕霉素+人參皂苷Rg1組、雷帕霉素+配伍組、雷帕霉素組。均于缺糖缺氧前30 min向細胞培養液中加入藥物，再同上進行缺糖缺氧和復糖復氧培養。每組重復3次。以Western blot法測定細胞p-PI3K Ⅰ、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平，測定方法同2.2。各種 I 抗的稀釋倍數為兔抗大鼠p-PI3K Ⅰ(1∶500)、兔抗大鼠p-Akt(1∶500)、兔抗大鼠p-mTOR(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1 000)。以目的條帶的IA與β-actin條帶的IA的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

2.4 PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號通路相關蛋白表達的測定 實驗分為正常組、模型組、黃芪甲苷組，人參皂苷Rg1組、配伍組、3-MA(PI3K Ⅲ抑制劑)+黃芪甲苷組、3-MA+人參皂苷Rg1組、3-MA+配伍組和3-MA組。藥物處理同前。每組重復3次。以Western blot法測定細胞PI3K Ⅲ、beclin-1及Bcl-2的蛋白水平。測定方法同2.2。各 I 抗的稀釋倍數為兔抗大鼠PI3K Ⅲ(1∶500)、兔抗大鼠beclin-1(1∶500)、兔抗大鼠Bcl-2(1∶500)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶1 000)。以目的條帶的IA與β-actin條帶的IA的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

3 統計學處理

用SPSS 21.0軟件進行統計分析。實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示。各指標數據經分析均為正態分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對OGD/R后PC12細胞LC3蛋白表達的影響

由圖1可見，缺糖缺氧2 h復糖復氧24 h后，細胞內LC3-Ⅰ蛋白表達減少、LC3-Ⅱ蛋白表達增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，黃芪甲苷組、人參皂苷Rg1組、黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍組及3-MA組LC3-Ⅰ蛋白表達增加、LC3-Ⅱ蛋白表達減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(P<0.01)，且黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的效應大于各藥物單用(P<0.01)，與3-MA比較差異無統計學顯著性。與模型組比較，雷帕霉素組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加(P<0.05)。

2 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號通路的影響

由圖2、表1可見，與正常組比較，模型組p-PI3K Ⅰ水平顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，人參皂苷Rg1組、配伍組、人參皂苷Rg1+雷帕霉素組、配伍+雷帕霉素組的p-PI3K Ⅰ水平顯著增多(P<0.01)；黃芪甲苷組、黃芪甲苷+雷帕霉素及雷帕霉素組對PI3K Ⅰ蛋白的磷酸化無顯著影響。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍組的效應大于兩藥單用組(P<0.01)；配伍+雷帕霉素組效應大于黃芪甲苷+雷帕霉素與人參皂苷Rg1+雷帕霉素組(P<0.01)，與配伍組比較差異無統計學顯著性。

Figure 1.Comparison of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the PC12 cells with different treatments. AST IV: astragaloside IV; Rg1: Ginsenoside Rg1. Mean±SD.n=3.▲▲P<0.01vsnormal group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;★★P<0.01vscombination group.

圖1 各組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比較

Figure 2.The images of Western blot for determining the protein levels of p-PI3K Ⅰ, p-Akt, p-mTOR in the PC12 cells with different treatments. 1: normal; 2: model; 3: astragaloside IV; 4: ginsenoside Rg1; 5: combination; 6: astragaloside IV + Rapa; 7: ginsenoside Rg1+ Rapa; 8: combination + Rapa; 9: Rapa.

圖2 Western blot實驗檢測各組細胞p-PI3KⅠ、p-Akt和p-mTOR的蛋白水平

與正常組比較，模型組的p-Akt蛋白水平顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，人參皂苷Rg1組、配伍組、人參皂苷Rg1+雷帕霉素組、配伍+雷帕霉素組的p-Akt蛋白水平顯著增高(P<0.05)；黃芪甲苷組、黃芪甲苷+雷帕霉素及雷帕霉素組對Akt蛋白的磷酸化無顯著影響。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍組的效應大于單用組(P<0.01)；配伍+雷帕霉素

表1 各組細胞p-PI3K Ⅰ、p-Akt和p-mTOR蛋白水平的比較

組效應顯著大于黃芪甲苷+雷帕霉素與人參皂苷Rg1+雷帕霉素組(P<0.05)，與配伍組比較差異無統計學顯著性。

與正常組比較，模型組的p-mTOR蛋白水平顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，人參皂苷Rg1組、配伍組、人參皂苷Rg1+雷帕霉素組及配伍+雷帕霉素組的p-mTOR蛋白水平顯著增高(P<0.05)；雷帕霉素及黃芪甲苷+雷帕霉素組可進一步下調p-mTOR的蛋白水平(P<0.05)。黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍組的p-mTOR蛋白磷酸化水平顯著高于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用組及配伍+雷帕霉素組(P<0.05)；配伍+雷帕霉素組p-mTOR的蛋白量顯著高于黃芪甲苷+雷帕霉素組、人參皂苷Rg1+雷帕霉素組(P<0.05)。

3 黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號通路的影響

由圖3、表2可見，與正常組比較，模型組PI3K Ⅲ的蛋白表達顯著增強(P<0.01)。與模型組比較，藥物組除人參皂苷Rg1外均能顯著下調PI3K Ⅲ蛋白表達(P<0.05)，且配伍組的效應顯著大于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用組(P<0.01)；配伍+3-MA組的效應顯著大于其它藥物組(P<0.05)；黃芪甲苷+3-MA的效應顯著強于3-MA組(P<0.05)；配伍組的效應強于3-MA組(P<0.05)。

Figure 3.The images of Western blot for determining the protein levels of PI3K Ⅲ, beclin-1, Bcl-2 in the PC12 cells with different treatments. 1: normal; 2: model; 3: astragaloside IV; 4:ginsenoside Rg1; 5: combination; 6: astragaloside IV + 3-MA; 7: ginsenoside Rg1 + 3-MA; 8: combination + 3-MA; 9: 3-MA.

圖3 Western blot實驗檢測各組細胞PI3K Ⅲ、beclin-1和Bcl-2的蛋白水平

與正常組比較，模型組的beclin-1蛋白表達顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，藥物組除人參皂苷Rg1組外均能顯著降低beclin-1蛋白表達(P<0.01)，且配伍組的效應顯著強于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用組(P<0.01)；配伍+3-MA組的效應顯著大于其它藥物組(P<0.05)。配伍組、黃芪甲苷+3-MA組效應均強于3-MA組(P<0.05)，配伍組與黃芪甲苷+3-MA組比較差異無統計學顯著性。

與正常組比較，模型組的Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，配伍與配伍+3-MA能顯著升高Bcl-2蛋白的表達(P<0.05)，且配伍組Bcl-2蛋白的表達顯著高于黃芪甲苷、人參皂苷Rg1單用組(P<0.05)；配伍+3-MA組的Bcl-2蛋白的表達顯著高于黃芪甲苷+3-MA與人參皂苷Rg1+3-MA組(P<0.05)；配伍+3-MA組與配伍組比較差異無統計學顯著性。

表2 各組細胞PI3K Ⅲ、beclin-1和Bcl-2蛋白表達的比較

討 論

自噬既可以作為一種防御機制清除胞質內受損的細胞器、代謝產物，進行亞細胞水平上的重構，保護受損的細胞，同時它作為一種細胞死亡程序誘導細胞主動性死亡[8-9]。根據細胞物質到達溶酶體腔途徑的不同，自噬可以分為大自噬、小自噬以及分子伴侶介導的自噬3種形式，通常所說的“自噬”主要指大自噬，其過程大致包括：自噬的誘導(形成自噬前體)、自噬體的形成、自噬溶酶體的形成以及內容物的降解[10]。本實驗根據前期研究結果，在建立PC12細胞氧糖剝奪后再復糖復氧細胞自噬性損傷模型的基礎上，利用LC3蛋白判斷藥物對自噬的影響。LC3是自噬相關基因(autophagy-related gene，Atg)8的同源物，自噬產生過程中LC3在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下脫去羥基端變成LC3-Ⅰ，隨后LC3-Ⅰ被Atg7激活并轉位到Atg3，在Atg3的作用下與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)連接并酯化形成LC3-Ⅱ，定位于自噬體的內膜和外膜，促進自噬體膜的延長與融合，參與自噬體的形成。LC3-Ⅱ為泛素樣蛋白，始終穩定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，被用來作為自噬體形成的標記，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小在一定程度上反映了自噬體的數量和細胞自噬水平的高低[1, 11-12]。

本研究結果顯示，PC12細胞在OGD 2 h、復氧復糖24 h后，細胞內出現LC3-Ⅱ蛋白表達，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，表明OGD/R后，產生了細胞自噬。黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、2藥配伍以及自噬抑制劑3-MA均能顯著降低自噬標志蛋白LC3-Ⅱ的表達，且黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍的效應強于單用。自噬誘導劑雷帕霉素可使OGD/R誘導的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值進一步升高。表明黃芪甲苷與人參皂苷Rg1能阻止OGD/R后PC12細胞自噬的發生，且二者配伍后的作用增強。

PI3K Ⅰ/Akt/mTOR和PI3K Ⅲ/becline1/Bcl-2信號轉導通路在自噬的調節中發揮了關鍵的作用[13-14]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種在進化上較為保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在2種不同的復合物形式，其中mTORC1對雷帕霉素敏感。當營養足夠時，mTORC1與失調51樣激酶(uncoordinated-51-like-kinase, ULK)復合物結合，促使ULK1(或ULK2)及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Atg13磷酸化，調節自噬的起始階段從而對自噬產生抑制作用。但是當環境營養不足(如缺糖缺氧)或雷帕霉素刺激下，mTORC1與ULK復合物分離，使mAtg13去磷酸化，介導自噬前體的形成、成核與延伸，從而誘導自噬[15-16]。激活的PI3K Ⅰ能在細胞中產生第二信使磷脂酰肌醇-3、4、5-三磷酸(phosphoinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1)的協助下，激活Akt，激活的Akt能夠抑制結節性硬化癥1/2(tuberous sclerosis complex，TSC1/2)復合物，從而激活mTORC1，進而抑制細胞自噬，自噬誘導劑雷帕霉素通過抑制mTORC1進而使細胞產生自噬[17-18]。

研究結果表明，OGD/R后，PC12細胞的p-PI3K Ⅰ、p-Akt、p-mTOR蛋白減少，表明OGD/R抑制了PI3K Ⅰ、Akt、mTOR蛋白的磷酸化，從而通過抑制PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號通路的激活誘導了自噬發生。人參皂苷Rg1、兩藥配伍、人參皂苷Rg1+雷帕霉素、配伍+雷帕霉素均可以使磷酸化的PI3K Ⅰ、Akt、mTOR蛋白增多，且配伍的效應強于黃芪甲苷或人參皂苷Rg1單用。黃芪甲苷對p-PI3K Ⅰ、p-Akt、p-mTOR蛋白水平無影響。雷帕霉素對PI3K Ⅰ、Akt蛋白的磷酸化無明顯影響，但顯著抑制mTOR蛋白的磷酸化，且能阻斷人參皂苷Rg1及黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對mTOR蛋白的激活作用。表明人參皂苷Rg1可以通過激活PI3K Ⅰ/Akt/mTOR信號通路減輕GOD/R誘導的自噬性損傷，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對該信號通路的激活有促進作用。

Beclin-1是酵母自噬基因Atg6的同源基因，beclin-1蛋白含有BH3(Bcl-2-homology3)結構域，可以通過卷曲螺旋結構域(coiled-coil domain，CCD)和進化保守結構域(evolutionarily conserved domain，ECD)與PI3K Ⅲ結合，形成beclin 1- PI3K Ⅲ復合體，介導自噬前體和自噬體膜的形成，從而上調細胞自噬水平[19-20]。Bcl-2含有BH3 受體，Bcl-2蛋白和PI3K Ⅲ分別結合beclin-1的不同區域，在正常情況下beclin-1與Bcl-2 家族蛋白持續結合，阻止beclin-1蛋白與PI3K Ⅲ結合，或者減少PI3K Ⅲ磷酸化活性，從而抑制自噬[3, 21-22]。所以，PI3K Ⅲ和beclin1作為正調控因子，抗凋亡因子Bcl-2作為負調控因子共同參與調控自噬，且自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤通過抑制PI3K-Ⅲ的活性而抑制自噬[23]。

本研究結果表明，OGD/R細胞的PI3K Ⅲ、beclin-1及Bcl-2蛋白表達上調，說明OGD/R后PI3K Ⅲ/beclin-1/Bcl-2信號通路被激活。藥物組除人參皂苷Rg1組外均可顯著下調PI3K Ⅲ和beclin-1蛋白表達，且黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍降低PI3K Ⅲ、beclin-1蛋白表達的效應強于藥物單用組。配伍+3-MA組及配伍組還能顯著升高Bcl-2蛋白的表達，其它各藥物對Bcl-2蛋白表達的下降無顯著影響。表明黃芪甲苷可能通過下調OGD/R后PI3K Ⅲ與beclin-1蛋白的表達，減少二者的結合，從而抑制PI3K Ⅲ/beclin-1信號通路阻止自噬的發生或抑制自噬的活性；黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍對PI3K Ⅲ/beclin-1信號通路的抑制作用有增強作用。除此之外，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍還可上調Bcl-2蛋白表達，可能使Bcl-2蛋白與beclin-1競爭性結合PI3K Ⅲ，導致PI3K Ⅲ與beclin-1的結合減少，延緩自噬體的發生，進一步達到增強對細胞自噬的抑制作用。

綜上所述，在缺糖缺氧2 h再復糖復氧24 h后，PC12細胞出現自噬，黃芪甲苷和人參皂苷Rg1均能減少OGD/R誘導的細胞自噬，且黃芪甲苷和人參皂苷Rg1配伍對PC12細胞自噬性損傷具有協同增效作用，其機制可能與調節PI3K Ⅰ/Akt/mTOR、PI3K Ⅲ/becline-1/Bcl-2信號通絡有關。

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(責任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Effects of astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 on autophagy and PI3K signaling pathways of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/ reoxygenation

DING Huang, LI Jing-xian, YANG Xiao-qian, TANG Biao, LIU Xiao-dan, TANG Ying-hong, DENG Chang-qing, HUANG Xiao-ping

(MolecularPathologyLaboratory,KeyLaboratoryofHunanProvinceforPreventionandTreatmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineonCardio-CerebralDiseases,KeyLaboratoryofHunanUniversitiesforCellBiologyandMolecularTechniques,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China.E-mail:jialeliu@hotmail.com)

AIM: To probe the effect and the mechanism of astragaloside IV and ginsenoside Rg1 on autophagy of PC12 cells induced by oxygen glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R). METHODS: The autophagy injury model of PC12 cells induced by OGD/R was established(PC12 cells were exposed to 2 h of OGD followed by 24 h of reoxygenation). The effects of astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 on autophagy of PC12 cells were observed, and the mechanism was studied through PI3K Ⅰ/Akt/mTOR and PI3K Ⅲ/becline-1/Bcl-2 signaling pathways. RESULTS: After OGD/R, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin PC12 cells was increased. Astragaloside IV, ginsenoside Rg1 and astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 restrained the increase in LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ, the effect of the combination was greater than using the drug alone. Ginsenoside Rg1, astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 up-regulated the phosphorylation level of PI3K Ⅰ, Akt and mTOR. The effects of the combination were stronger than those of using the drug alone. Astragaloside IV, astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 inhibited the protein expression of PI3K Ⅲ and becline-1, the effects of the combination were better than those of single astragaloside IV and single ginsenoside Rg1. Meanwhile, the combination treatment increased Bcl-2 protein expression. CONCLUSION: The autophagy of PC12 cells induced by OGD/R is inhibited by astragaloside IV and ginsenoside Rg1. Furthermore, astragaloside IV combined with ginsenoside Rg1 plays synergitic inhibition on autophagy, the mechanism may be related to PI3K Ⅰ/Akt/mTOR and PI3K Ⅲ/becline-1/Bcl-2 signaling pathways.

Astragaloside IV; Ginsenoside Rg1; PC12 cells; Autophagy; PI3K Ⅰ/Akt/mTOR signaling pathway; PI3K Ⅲ/becline-1/Bcl-2 signaling pathway

1000- 4718(2016)11- 2003- 07

2016- 06- 06

2016- 09- 30

湖南省科技廳一般項目(No.2014SK3001)；中西醫結合防治心腦血管疾病的相關基礎研究；“中醫藥防治心腦血管疾病基礎研究”湖南省自然科學創新群體基金

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.014

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