C-反應蛋白誘導人腎小管上皮細胞凋亡*

謝愷慶， 楊海波， 林洪升， 陳 麗， 霍冬梅， 史應龍， 覃詩雁， 周紅衛

(廣西醫科大學 1第一附屬醫院腎內科暨血液凈化部，2微生物學教研室， 廣西 南寧 530021)

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C-反應蛋白誘導人腎小管上皮細胞凋亡*

謝愷慶1△， 楊海波2， 林洪升2， 陳 麗1， 霍冬梅1， 史應龍1， 覃詩雁1， 周紅衛1

(廣西醫科大學1第一附屬醫院腎內科暨血液凈化部，2微生物學教研室， 廣西 南寧 530021)

目的： 探討與微炎癥狀態相應的C-反應蛋白(CRP)水平是否誘導腎小管上皮細胞凋亡。方法:以微炎癥狀態相應的CRP濃度刺激HK-2細胞。采用AnnexinⅤ-FITC、PI染色和流式細胞術檢測凋亡細胞的百分率。采用Hoechst 33258染色觀察腎小管上皮細胞凋亡的形態學改變。比色法檢測細胞caspase-3活性。Real-time PCR檢測促凋亡基因bax、抗凋亡基因bcl-2 的mRNA表達。結果:CRP呈劑量和時間依賴性地誘導HK-2 細胞凋亡，細胞凋亡在CRP濃度為10 mg/L時達高峰，在20 mg/L時則以晚期凋亡和壞死為主。Hoechst 33258細胞核染色顯示CRP作用的HK-2細胞呈現染色質濃縮、碎裂或染色質邊集等細胞凋亡的特點。CRP增高細胞caspase-3的酶活性、上調促凋亡基因bax的表達和下調抗凋亡基因bcl-2的表達。結論:CRP輕度增高可誘導腎小管上皮細胞凋亡。

C-反應蛋白； 腎小管上皮細胞； 細胞凋亡

腎小管間質纖維化是各種慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)發展至終末期腎衰竭的共同途徑,是決定腎臟疾病預后的主要因素[1]。腎小管間質纖維化表現為腎小管萎縮缺失、細胞外基質在腎間質過度沉積以及炎癥細胞浸潤。在損傷因子作用下，腎小管上皮細胞呈隱匿而累積性的過度凋亡，是導致腎小管萎縮缺失和小管間質纖維化的主要原因之一[2]。慢性炎癥在CKD腎功能喪失中扮演主要作用，炎癥引起腎小管間質進行性纖維化以及腎小管萎縮，最終腎單位完整性被破壞，腎功能喪失。

慢性腎臟病患者中普遍存在全身慢性微炎癥狀態并且隨著腎功能的下降而加重，表現為C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)等血清炎癥標志物持續低水平增高[3]。對CKD腎活檢發現CRP普遍沉積于腎小管和腎間質中[4-5]。CRP是人類主要的急性期反應蛋白，其不但是敏感的炎癥標志物，還是炎癥介質，可直接參與調控炎癥和纖維化過程[6-7]。CRP作為一種活性的炎癥蛋白，可誘導血管內皮細胞和平滑肌細胞凋亡[8-9]。CRP是否可以誘發腎小管上皮細胞凋亡而影響腎小管間質纖維化目前仍不清楚。我們以體外培養的人近端腎小管上皮細胞系HK-2細胞為靶細胞，觀察類似體內CKD微炎癥狀態下的CRP濃度是否可誘導腎小管上皮細胞凋亡，從而闡述CRP在CKD進展中潛在的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人近端腎小管上皮細胞的永生系細胞株HK-2細胞購自ATCC。重組人CRP購自Calbiochem；DMEM/F12培養基和胎牛血清購自Gibco BRL； Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Bender Med Systems；Hoechst 33258試劑盒和caspase-3活性檢測試劑盒購自中國南京凱基生物試劑公司；總RNA提取試劑盒購自QIAGEN；反轉錄及real-time PCR試劑盒購自TaKaRa；羊抗人CRP抗體購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 細胞培養 HK-2細胞在37 ℃水浴復蘇后，以每孔1×105細胞接種于6孔板，在37 ℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養。 待細胞生長至70%～80%融合時改為無血清DMEM/F12培養，使其生長同步化后進行實驗。

2.2 Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染色檢測細胞凋亡 以不同濃度(0、0.1、1、10、20 mg/L)CRP以及CRP 10 mg/L +抗CRP抗體10 mg/L作用 HK-2細胞48 h，無血清DMEM/F12培養基培養細胞為陰性對照。另外用CRP 10 mg/L 處理HK-2細胞不同時間(0 h、12 h、24 h、48 h)。用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，Annexin V-FITC和 PI雙染色細胞后，流式細胞術檢測凋亡細胞。

2.3 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 HK-2細胞接種于預先放在6孔培養板內的蓋玻片上。以含1、10 mg/L CRP的無血清DMEM/F12培養基培養48 h，以不含CRP的無血清培養基為陰性對照。蓋玻片用4%多聚甲醛溶液4 ℃固定10 min，加入終濃度2 mg/L的Hoechst 33258染色液，37 ℃避光孵育5 min。熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。

2.4 Caspase-3活性的比色法檢測 用10 mg/L CRP處理HK-2細胞0、6、12、24 h，收集細胞檢測caspase-3活性。Caspase-3活性采用比色法測定。HK-2細胞用胰蛋白酶消化和收集，重懸在50 μL冰冷lysis buffer(50 mmol/L HEPES、1 mmol/L DTT、0.1 mmol/L EDTA、0.1% CHAPS，pH 7.4)中，4 ℃ 10 000×g離心1 min后，吸取細胞裂解上清液，根據試劑盒說明書進行caspase-3活性檢測。

3 統計學處理

實驗重復3次，數據以均數±標準差(mean±SD)表示。經正態性檢驗，所有定量變量符合正態分布。多組均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗。所有統計應用SPSS 13.0統計軟件進行。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 流式細胞術檢測CRP誘導腎小管上皮細胞凋亡

CRP以劑量依賴方式誘導HK-2 細胞凋亡(P<0.01)，早期凋亡在CRP濃度為10 mg/L達高峰，CRP濃度為20 mg/L時，細胞以晚期凋亡和壞死為主。加入抗CRP抗體中和CRP后，CRP誘導腎小管上皮細胞凋亡的作用顯著下降(P<0.01)，見圖1。HK-2細胞用含10 mg/L CRP的無血清DMEM/F12培養基培養0 h、12 h、24 h、48 h顯示，CRP以時間依賴方式誘導HK-2 細胞凋亡(P<0.01), 細胞凋亡在24 h開始增高，48 h進一步增高。晚期凋亡和壞死在48 h亦顯著增加, 見圖2。

Figure 1. CRP induced apoptosis of HK-2 cells in a dose-dependent manner detected by Annexin V-FITC-PI staining. HK-2 cells were treated with 0 (A), 0.1 (B), 1 (C), 10 (D), 20 (E) mg/L CRP, and CRP (10 mg/L) in the presence of anti-human 10 mg/L CRP IgG (F) for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;##P<0.01vsCRP 10 mg/L.

圖1 流式細胞術檢測CRP誘導的腎小管上皮細胞凋亡的劑量效應

Figure 2.CRP induced apoptosis of HK-2 cells in a time-dependent manner detected by Annexin V-FITC-PI staining. HK-2 cells were incubated with CRP (10 mg/L) at 0 h (A), 12 h (B), 24 h (C) and 48 h (D). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

圖2 流式細胞術檢測CRP誘導的腎小管上皮細胞凋亡的時間效應

2 Hoechst 33258染色檢測CRP誘導腎小管上皮細胞凋亡

圖3顯示，隨著CRP刺激劑量增加，腎小管上皮細胞表現出凋亡的特點，光學顯微鏡下見細胞皺縮變圓，與鄰近細胞脫離，折光能力增加，核仁裂解；Hoechst 33258染色見細胞核染色質濃縮或碎裂，部分呈核染色質邊集。

Figure 3. CRP induced apoptosis of HK-2 cells determined by Hoechst 33258 staining (×200).

圖3 Hoechst 33258核染色檢測CRP誘導的腎小管上皮細胞凋亡

3 CRP誘導腎小管上皮細胞caspase-3酶活性增高

HK-2細胞用含10 mg/L CRP的無血清DMEM/F12培養基培養0 h、6 h、12 h、24 h，結果如圖4所示，caspase-3活性呈時間依賴性增高(P<0.01)，12 h和24 h較對照組差異有統計學顯著性(P<0.05)，12 h和24 h之間差異無統計學顯著性。

Figure 4.Caspase-3 activity induced by CRP. HK-2 cells were incubated with CRP (10 mg/L) at different time points. Caspase-3 activity were measured by colorimetric assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h.

圖4 CRP誘導的腎小管上皮細胞caspase-3酶活性變化

4 CRP影響腎小管上皮細胞凋亡基因bax和bcl-2的表達

HK-2細胞用含10 mg/L CRP的無血清DMEM/F12培養基培養0 h、12 h、24 h、48 h，CRP以時間依賴方式影響凋亡相關基因bax和bcl-2的mRNA表達，Bax mRNA的表達隨時間延長而上調，24 h 達高峰，但48 h 較24 h下降(P<0.05)，見圖5。Bcl-2 mRNA的表達隨時間延長而下調，12 h顯著性下降，48 h進一步下降(P<0.01)，見圖6。

Figure 5.CRP induced the mRNA expression of Bax in the HK-2 cells. HK-2 cells were incubated with CRP (10 mg/L) at different time points. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h.

圖5 CRP誘導的腎小管上皮細胞Bax mRNA的表達

討 論

細胞凋亡最早被認為是一種清除機體衰老或無用細胞的生理性機制，現在認識到許多病理過程都出現細胞凋亡，如缺血性或腎毒性的腎損傷，梗阻性腎病和多囊腎等[10-15]。在多種進展性慢性腎臟病動物模型中，腎小管萎縮和腎間質纖維化的程度與腎小管上皮細胞的凋亡率密切相關，腎小管上皮細胞凋亡在進行性腎功能減退和進行性腎小管萎縮和腎間質纖維化中起重要作用[16-18]。晚期慢性腎臟病病理表現為腎小管萎縮和腎間質纖維化。腎小管細胞在各種損傷因子作用下發生凋亡，導致小管細胞形態改變和缺失，腎小管細胞缺失、進一步加重腎小管間質纖維化[2]。

Figure 6.CRP induced the mRNA expression of Bcl-2 in the HK-2 cells. HK-2 cells were incubated with CRP (10 mg/L) at different time points. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h.

圖6 CRP誘導腎小管上皮細胞Bcl-2 mRNA的表達

CRP作為一種活性的炎癥蛋白，可誘導血管內皮細胞和平滑肌細胞凋亡[8-9]。本實驗亦發現，CRP可誘導腎小管上皮細胞凋亡，并且呈劑量和時間依賴性反應。在10 mg/L CRP刺激下，細胞凋亡顯著增高，而生理濃度1 mg/L與對照比較無顯著差異。在慢性腎衰竭時，一般血清CRP濃度超過5～10 mg/L,而小于100 mg/L。在正常狀態下，CRP分子量為105 kD，無法透過腎小球濾過膜濾出，但出現腎小球病變時，腎小球濾過膜通透性增高，CRP可濾出進入腎小管，在原尿中如果CRP未被腎小管上皮細胞重吸收，其濃度接近血清水平。我們采用濃度為10 mg/L 的CRP可誘導腎小管上皮細胞凋亡，提示隨著慢性腎臟病患者腎功能的下降，血循環中升高的CRP可透過腎小球濾過膜刺激近端腎小管上皮細胞凋亡。

Caspase家族是一類在細胞凋亡過程中被激活的半胱氨酸蛋白酶家族，它的激活與超常表達均引起細胞凋亡。目前已確定的caspase家族成員有14種。其中caspase-3是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志[19]。本研究結果顯示，在CRP誘導的HK-2細胞凋亡中，caspase-3蛋白酶活性增高，表明CRP誘導HK-2細胞凋亡是通過激活caspase-3，啟動caspase級聯反應而實現的。

Bcl-2家族是凋亡相關基因家族，分為致凋亡基因(bax、bak、bad等)和抗凋亡基因(bcl-2、bcl-x等)[20]。在腎小管上皮細胞中，Bcl-2和Bax蛋白均存在線粒體膜上。而Bax與Bcl-2有很高同源性，兩者形成異源二聚體，Bax抑制Bcl-2活性，促進細胞凋亡，其主要機制與誘導線粒體損傷而觸發細胞凋亡有關[21-22]。 用濃度為10 mg/L 的CRP處理腎小管上皮HK-2細胞，可見Bcl-2 mRNA的表達受到抑制，隨刺激時間的延長mRNA的表達降低, 而Bax mRNA的表達增強, 隨刺激時間的延長升高，提示低水平CRP可通過線粒體途徑誘導腎小管上皮細胞凋亡。同時我們發現48 h Bax mRNA的表達顯著性降低，這可能與已走向凋亡的細胞中不表達或低表達Bax有關[23]。

綜上所述，體外實驗發現低水平CRP可誘導腎小管上皮細胞凋亡，提示微炎癥狀態下CRP具有引起腎小管細胞缺失而加重腎小管萎縮和間質纖維化的作用。誘導凋亡的機制與caspase-3凋亡酶活化、促凋亡基因bax上調、抗凋亡基因bcl-2下調有關。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

C-reactive protein induces apoptosis in human renal tubular epithelial cells

XIE Kai-qing1, YANG Hai-bo2, LIN Hong-sheng2, CHEN Li1, HUO Dong-mei1,SHI Ying-long1, QIN Shi-yan1, ZHOU Hong-wei1

(1RenalDivisionofTheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofMicrobiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail: 1533459363@qq.com)

AIM: To explore whether the C-reactive protein (CRP) level in microinflammation state induces the apoptosis of renal tubular epithelial cells. METHODS: HK-2 cells were stimulated with recombinant human CRP. Annexin-FITC-PI staining and flow cytometry were used to detect the percentage of apoptotic cells. Morphology observation of apoptosis was assessed by Hoechst 33258 staining. Caspase-3 activity was measured by a colorimetric assay. The expression of apoptotic genebaxand anti-apoptotic genebcl-2 at mRNA levels was determined by real-time PCR. RESULTS: CRP induced apoptosis of HK-2 cells in a time- and dose-dependent manner. The maximal apoptotic effect of CRP concentration was 10 mg/L CRP at concentration of 20 mg/L. CRP treatment was associated with the characteristic morphological features of apoptosis such as condensation, fragmentation or margination of nuclear chromatin. CRP exposure increased caspase-3 activity, up-regulated the mRNA expression of Bax and down-regulated the mRNA expression of Bcl-2. CONCLUSION: Slightly increased CRP level has the potential to induce apoptosis of renal tubular cells.

C-reactive protein; Renal tubular epithelial cells; Apoptosis

1000- 4718(2016)11- 2020- 06

2016- 06- 01

2016- 07- 25

廣西自然科學基金資助項目(No. 2013GXNSFAA019149)；廣西高校科研立項項目(No. 201204LX054)

R691.3; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.017

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