異丙酚通過抑制JAK/STAT通路減輕肝冷缺血再灌注大鼠腎損傷*

王 菲， 喻文立， 賈莉莉， 顧向前， 翁亦齊， 杜洪印

(1天津醫科大學一中心臨床學院， 天津 300070； 2天津市第一中心醫院麻醉科， 天津 300192)

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異丙酚通過抑制JAK/STAT通路減輕肝冷缺血再灌注大鼠腎損傷*

王 菲1， 喻文立2△， 賈莉莉1， 顧向前1， 翁亦齊2， 杜洪印2

(1天津醫科大學一中心臨床學院， 天津 300070；2天津市第一中心醫院麻醉科， 天津 300192)

目的： 探討JAK/STAT信號通路在異丙酚減輕大鼠肝冷缺血再灌注后腎損傷中的作用。方法:SD大鼠隨機分為4組(n=8)：假手術組(sham組)；肝冷缺血再灌注模型組(I/R組)；異丙酚組(Pro組)，于再灌注前5 min經右側股靜脈給予異丙酚20 mg·kg-1·h-1持續泵注30 min；JAK2抑制劑AG490組(AG490組)，于建立模型前30 min腹腔注射AG490 10 mg/kg。再灌注6 h后處死大鼠，采集血樣和腎組織標本，檢測血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度及腎組織超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平；觀察腎組織的病理學改變，并進行腎小管損傷評分；檢測腎組織細胞凋亡并計算凋亡指數(AI)；檢測p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平。結果:與sham組比較，I/R組血清的Cr和BUN濃度、腎組織的MDA含量、腎小管損傷評分及AI均明顯升高，SOD活性降低，p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平顯著上調(P<0.05)。與I/R組相比，Pro組和AG490組的血清BUN和Cr濃度、腎組織的MDA含量、AI和腎小管損傷評分降低，SOD活性升高，p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白水平顯著下調(P<0.05)。結論:異丙酚可減輕肝冷缺血再灌注后腎損傷，其機制可能與抑制JAK/STAT信號通路激活有關。

異丙酚； 缺血再灌注損傷； JAK/STAT信號通路； 肝； 腎

肝冷缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)是創傷性休克、肝臟外科臨床中常見的病理生理過程，不僅會導致肝臟損傷，還可導致遠隔臟器的損傷及功能下降，其中腎臟是最容易受累的臟器之一[1]，目前尚缺乏有效對策。異丙酚(propofol,Pro)作為一種臨床常用的靜脈麻醉藥物，可通過抗炎、抗氧化及抗凋亡等不同機制發揮器官保護作用[2]。研究表明，異丙酚可減輕腎缺血再灌注損傷[3-4]，且Janus激酶/信號轉導和轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路的活化與腎缺血再灌注損傷密切相關[5]，但異丙酚能否減輕肝冷缺血再灌注后的腎損傷以及JAK/STAT通路是否與此作用有關，仍不十分明確。本實驗采用大鼠肝冷缺血再灌注模型，探討JAK/STAT信號通路在異丙酚減輕大鼠肝冷缺血再灌注腎損傷中的作用，為異丙酚應用于移植手術防治遠隔器官損傷提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

異丙酚(AstraZeneca)；AG490(Selleck)；IL-6和TNF-α ELISA試劑盒(上海拜沃公司)；蛋白質定量試劑盒、MDA試劑盒和SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TUNEL試劑盒(Roche)；兔抗p-JAK2和p-STAT3(Abcam)；兔抗p-STAT1及GAPDH(CST)；HRP標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；化學發光試劑盒(Millipore)。熒光顯微鏡(Olympus)；全自動生化分析儀(Roche)。

2 動物選擇及分組

SPF級成年健康雄性SD大鼠32只，8～10周齡，體重200～250 g，購于解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。采用隨機數字表法將大鼠分為4組：假手術組(sham組)僅開腹，游離肝臟周圍血管及韌帶后關腹；肝冷缺血再灌注模型組(I/R組)參照文獻建立肝冷缺血再灌注模型；異丙酚組(Pro組)建立模型，于再灌注前5 min經右側股靜脈給予異丙酚，按20 mg·kg-1·h-1的劑量持續泵注30 min；AG490(JAK2抑制劑)組于建立模型前30 min腹腔注射AG490 10 mg/kg。

3 主要方法

3.1 模型制備 參照文獻[6]并加以改良，術前禁食12 h，自由飲水。腹腔注射5%水合氯醛60 mg/kg麻醉，備皮消毒后，經腹正中切口入腹，顯露劍突，離斷肝鐮狀韌帶并鈍性分離肝上下腔靜脈，在右腎靜脈水平以上鈍性分離肝下下腔靜脈，腸系膜上靜脈與脾靜脈匯合處以上分離門靜脈及肝固有動脈，同時電凝右腎上腺靜脈和肝食管靜脈叢。然后使用無損傷血管夾夾閉肝固有動脈和門靜脈，靠近右腎靜脈水平以上阻斷肝下下腔靜脈，從而阻斷入肝血流。于門靜脈阻斷水平以上用肝素針灌注4 ℃肝素生理鹽水1 mL，將肝內血液沖入體循環，之后夾閉肝上下腔靜脈。然后用顯微組織剪在肝下下腔靜脈血管夾上方開口1～2 mm，作為灌注液流出道，經門靜脈灌注道常壓灌注4 ℃乳酸林格氏液6～8 mL/min，灌注時間為40 min。可見肝臟逐漸變至土黃色，觸之冰涼。灌注結束后，使用8-0無損傷縫合線縫合肝下下腔靜脈流出道，棉球按壓門靜脈穿刺點止血，依次開放肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈、門靜脈、肝固有動脈，恢復肝臟血流，用溫生理鹽水沖洗腹腔后關腹。術后烤燈照射至大鼠復蘇，自由飲水。

3.2 血清BUN、Cr、IL-6和TNF-α濃度的測定 于再灌注6 h時經下腔靜脈抽取血樣4 mL，離心后留取上清，應用全自動生化分析儀檢測血清BUN及Cr的濃度。酶聯免疫吸附法測定血清IL-6和TNF-α的含量。

3.3 腎組織MDA和SOD水平的測定 采血后，取左腎組織制備10%組織勻漿，參照MDA及SOD試劑盒說明書，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

3.4 腎組織的病理學觀察 取右腎組織，10%中性甲醛溶液固定后進行石蠟包埋，制備病理切片(厚約4 μm)，HE染色后于光鏡下(×200)觀察腎組織病理學結果。由兩位病理科醫師雙盲下采用Jablonski半定量評分[7]，評價腎小管損傷程度(0～4分)。正常為0分；最輕度損傷(<5%的皮質或髓質外層損傷)為1分；輕度損傷(5%～25%的皮質或髓質外層損傷)為2分；中度損傷(26%～75%的皮質或髓質外層損傷)為3分；嚴重損傷(>75%的皮質或髓質外層損傷)為4分。

3.5 腎組織細胞凋亡的檢測 腎組織切片脫蠟水化后，采用TUNEL法檢測細胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進行，后用DAPI復染。熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，正常細胞核為藍色，凋亡細胞核為紅色；每張切片隨機取5個高倍視野(×200)，計數凋亡細胞數和細胞總數，計算凋亡指數(apoptotic index， AI; %)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

3.6 p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白水平的檢測 采用Western blot法進行檢測。取左腎組織，稱重、研磨，加蛋白裂解液(質量∶體積=1∶10)、蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑，勻漿裂解30 min后，4 ℃ 13 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法蛋白定量。上樣量為50 μg，于10%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，隨后轉印至PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，隨后加入兔抗p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min 3次；加入 II 抗，于室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發光自顯影，凝膠成像系統成像，采用Gel-Pro32圖像分析軟件測定蛋白條帶的灰度值，以p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3分別與內參照灰度的比值反映目的蛋白的水平。

4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，多樣本各組均數間的多重比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 血清BUN、Cr、IL-6和TNF-α及腎組織MDA、SOD的水平

與sham組比較，其余3組腎功能受損，BUN和Cr濃度明顯升高，炎癥反應及氧化應激增強，IL-6和TNF-α濃度及MDA含量明顯升高，SOD水平降低(P<0.05)；與I/R組比較，Pro組和AG490組腎功能明顯改善，BUN和Cr濃度降低，炎癥反應及氧化應激緩解，IL-6和TNF-α濃度及MDA含量降低，SOD水平升高(P<0.05)，見表1。

表1 血清BUN、Cr、IL-6和TNF-α及腎組織MDA、SOD的水平

2 腎組織的病理學改變

光鏡下觀察sham組腎小管排列整齊，間質無充血水腫；I/R組可見多數腎小管上皮細胞水腫，細胞空泡變性，腎小管擴張，管腔狹窄，排列紊亂，間質擴張淤血；Pro組和AG490組損傷較I/R組減輕，腎小管上皮細胞空泡樣改變減少，腎小管輕度擴張，腎小管上皮細胞排列趨于正常，間質淤血明顯減輕，見圖1。

3 腎組織的細胞凋亡情況

Sham組僅見極少凋亡細胞；I/R組腎組織細胞凋亡明顯，AI升高(P<0.05)；給予Pro和AG490后，細胞凋亡明顯減輕，AI降低(P<0.05)，見圖2。

4 Western blot實驗結果

Sham組的p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3幾乎測不出，缺血再灌注后p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平均顯著增加(P<0.05)；與I/R組比較，Pro組和AG490組p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平均降低(P<0.05)，提示異丙酚和AG490同樣可抑制JAK/STAT通路的激活，見圖3。

Figure 1. The pathological changes of the kidney tissues (HE staining,×200). Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖1 各組大鼠腎組織病理學改變

Figure 2.Apoptosis analysis of the kidney tissues with different treatments (TUNEL staining,×200). AI: apoptotic index. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖2 TUNEL染色觀察各組大鼠細胞凋亡情況

Figure 3.The protein levels of p-JAK2, p-STAT1a and p-STAT3 in the kidney tissues. Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖3 Western blot法檢測p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平

討 論

肝臟缺血再灌注損傷是引發多器官功能障礙的重要因素[1, 8]。由于腎臟的解剖與生理特征，阻斷肝血流以及再灌注過程均可引起腎損傷，嚴重影響患者生存和預后。因此，研究肝缺血再灌注后腎損傷機制并制定有效的防治措施至關重要。

已有研究證實，異丙酚可改善離體肥厚性心肌缺血再灌注損傷后的功能恢復[9]，且減輕高糖血癥大鼠的腎缺血再灌注損傷[10]。然而，對于肝冷缺血再灌注后異丙酚的腎臟保護作用研究甚少，且潛在機制仍不明確。因此本研究參照文獻建立肝冷缺血再灌注模型，對靜脈用藥異丙酚的腎保護作用進行研究。參照文獻[11-12]及預實驗，本研究選擇于再灌注前5 min給予異丙酚20 mg·kg-1·h-1，持續泵注30 min，于建立模型前30 min腹腔注射AG490 10 mg/kg，并于再灌注后6 h對各項指標進行檢測。

肝臟缺血再灌注誘發腎損傷涉及多種因素。再灌注后，激活的Kupffer細胞大量釋放IL-6、TNF-α等促炎因子, 其可介導趨化因子的表達，促進中性粒細胞的激活、聚集與浸潤，誘發炎癥級聯反應[13]。活化的中性粒細胞向內皮下間隙聚集，產生大量的活性氧，生物酶及細胞因子，導致腎臟的直接損傷[8]。MDA含量以及SOD活性可反映腎臟氧化應激水平。內皮細胞的完整性對于減慢白細胞向受損區域聚集，緩解腎臟損傷至關重要。Lee等[14]研究發現肝缺血再灌注可導致顯著的腎臟內皮細胞凋亡，加劇腎臟損傷。本研究結果表明，給予異丙酚后腎功能明顯改善，BUN和Cr濃度降低，炎癥反應及氧化應激緩解，IL-6和TNF-α濃度及MDA含量降低，SOD水平升高，病理損傷減輕，腎小管內皮細胞凋亡減少。然而，其腎保護作用所涉及的具體信號通路尚需要進一步研究。

JAK/STAT信號通路作為細胞內的一條重要的信號傳導途徑，分別由JAKs蛋白家族和STATs蛋白家族組成，參與細胞生長、增殖分化、炎癥、凋亡等多種病理生理過程。研究表明，JAK/STAT信號通路參與缺血再灌注損傷過程，然而此通路及其抑制劑AG490在缺血再灌注損傷過程中的作用仍存在爭議。Buendia 等[15]研究發現褪黑素受體激動劑Neu-P11能夠激活JAK/STAT通路減輕腦缺血再灌注模型中氧化應激反應。Si 等[16]發現抑制JAK2/STAT3通路減輕了腎缺血再灌注腎小管細胞凋亡。與李毅等[17]研究結果相一致，我們發現生理狀態下，腎組織中僅有少量的p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白，而缺血再灌注損傷后p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平顯著增高，給予JAK2特異性抑制劑AG490后，p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3的蛋白水平下調。與此同時，AG490組大鼠腎功能得到改善，腎臟病理損傷減輕，炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡均明顯減輕。提示本研究模型中，抑制JAK/STAT信號通路激活可減輕腎臟損傷。與此同時，Western blot實驗的結果顯示給予異丙酚后，p-JAK2和p-STAT1、p-STAT3的蛋白水平明顯降低，提示異丙酚可抑制JAK/STAT信號通路激活。表明異丙酚減輕肝冷缺血再灌注后腎損傷可能與抑制該通路激活有關。

綜上所述，JAK/STAT信號通路的激活參與了肝冷缺血再灌注所致腎損傷的發生，異丙酚可通過抑制此通路激活減輕炎癥反應、氧化損傷與細胞凋亡從而發揮其腎臟保護作用。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Propofol attenuates kidney injury after liver cold ischemia/reperfusion in rats via inhibiting JAK/STAT signaling activation

WANG Fei1, YU Wen-li2, JIA Li-li1, GU Xiang-qian1, WENG Yi-qi2, DU Hong-yin2

(1TheFirstCenterClinicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;2DepartmentofAnesthesiology,TianjinFirstCenterHospital,Tianjin300192,China.E-mail:yzxyuwenli@163.com)

AIM: To investigate the role of Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) signaling pathway in propofol (Pro)-induced reduction of kidney injury after liver cold ischemia/reperfusion in rats. METHODS: Sprague-Dawley rats were assigned randomly to 4 groups (n=8 each group): sham operation group (sham group); liver cold ischemia/reperfusion model group (I/R group); propofol group (Pro group): propofol at dose of 20 mg·kg-1·h-1was infused continuously for 30 min via right femoral vein 5 min before reperfusion; JAK2 inhibitor AG490 group (AG490 group): AG490 at dose of 10 mg/kg was applied by intraperitoneal injection 30 min before establishing the model. The rats were sacrificed at 6 h after reperfusion. Blood samples and kidney tissues were obtained to detect the serum concentrations of creatinine (Cr), blood urea nitrogen (BUN), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), and the tissue levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD). The pathologic changes of the renal tissues and nephritic cell apoptosis were analyzed, the damage of the renal tubules was scored and apoptotic index (AI) was calculated. The protein levels of p-JAK2, p-STAT1 and p-STAT3 were determined by Western blot. RESULTS: Compared with sham group, the levels of Cr, BUN, IL-6, TNF-α and MDA, AI, and renal tubular damage score were significantly increased, the SOD activity was decreased, and the protein levels of p-JAK2, p-STAT1 and p-STAT3 were up-regulated in I/R group (P<0.05). Compared with I/R group, the levels of Cr, BUN, IL-6, TNF-α and MDA, AI, and renal tubular damage score were significantly decreased, the SOD activity was increased, and the protein levels of p-JAK2, p-STAT1 and p-STAT3 was down-regulated in Pro group and AG490 group (P<0.05). CONCLUSION: Propofol reduces kidney injury induced by liver cold ischemia/reperfusion, and the mechanism is possibly associated with inhibiting the JAK/STAT pathway activation.

Propofol; Ischemia/reperfusion injury; JAK/STAT signaling pathway; Liver; Kidney

1000- 4718(2016)11- 2026- 05

2016- 05- 31

2016- 08- 11

天津市衛生行業重點攻關項目(No. 13KG105)；天津市衛生局科技基金(No. 2011KY12)；天津市應用基礎研究計劃面上項目(No.05YFJMJC14800)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.018

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