CD147在不明原因自然流產患者絨毛組織的表達*

唐傳玲， 滕曉明， 車 映， 李大金

(1同濟大學附屬第一婦嬰保健院，上海 201204； 2復旦大學附屬婦產科醫院，上海 200011)

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CD147在不明原因自然流產患者絨毛組織的表達*

唐傳玲1， 滕曉明1， 車 映1， 李大金2△

(1同濟大學附屬第一婦嬰保健院，上海 201204；2復旦大學附屬婦產科醫院，上海 200011)

目的： 分析CD147在不明原因自然流產患者絨毛組織中的表達水平，并探討其生物學功能。方法:收集人早孕期正常和不明原因自然流產婦女的絨毛組織，采用免疫組織化學、RT-PCR 和Western blotting法檢測CD147的表達，比較CD147在正常早孕與不明原因自然流產婦女絨毛組織的表達差異。體外分離純化獲得正常人早孕期滋養細胞，采用免疫細胞化學驗證CD147在滋養細胞的表達，引入抗CD147中和性抗體處理人滋養細胞，采用BrdU增殖實驗和Transwell侵襲實驗分析滋養細胞增殖和侵襲能力的變化。結果:正常早孕期絨毛組織和滋養細胞高表達CD147，不明原因自然流產絨毛組織CD147的mRNA和蛋白表達水平均低于正常早孕期絨毛組織。抗CD147中和性抗體處理原代人滋養細胞后，滋養細胞的增殖能力未發生明顯變化，侵襲能力下降。結論:人絨毛組織CD147的異常低表達可能與不明原因早期妊娠失敗相關，CD147通過調控滋養細胞的侵襲能力參與正常妊娠的維持。

不明原因自然流產； CD147； 滋養細胞； 細胞增殖； 細胞侵襲

自然流產是指妊娠早期胚胎發育自然終止、丟失的病理過程。排除環境因素，染色體異常，母方生殖道解剖、內分泌、免疫、感染因素和血栓形成傾向，以及父方因素的自然流產稱為不明原因自然流產(unexplained spontaneous abortion， USA)。USA在連續發生3次和3次以上反復自然流產人群中的比例高達50%以上，嚴重影響女性的生殖健康。雖然目前臨床上自然流產的治療和預防取得了很大進展，但其發病機制仍未完全闡明。

CD147是basigin基因表達的一個跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。CD147在許多細胞和組織中表達，參與介導細胞間識別、細胞生長分化以及組織重建等生理過程。研究發現，CD147可以通過腫瘤細胞間的相互作用誘導基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的產生，從而降解基質，促進腫瘤細胞的生長和浸潤，因此又被稱為細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)[1]。CD147在多種腫瘤細胞高表達，除激活MMPs外，還可活化多種促炎介質和細胞因子，在腫瘤細胞的侵襲和轉移中起著重要作用[2]。

妊娠初期，滋養細胞具有與腫瘤細胞類似的增殖和侵襲行為[3]。大量研究已證實，MMPs在早孕期絨毛組織和蛻膜組織廣泛表達，在滋養細胞入侵子宮蛻膜及子宮螺旋動脈重塑中具有重要作用[4]。亦有文獻報道，作為MMPs誘導因子的CD147表達于人早期囊胚和足月胎盤[5-6]，子癇前期及子癇患者胎盤組織中CD147表達水平下降[7]。然而目前關于CD147表達與不明原因自然流產的關系并未見報道。本研究通過收集臨床標本觀察CD147在正常早孕和不明原因自然流產患者絨毛組織中的表達水平，體外分離人早孕期滋養細胞，初步探討CD147表達水平對滋養細胞增殖和侵襲能力的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人體組織標本的采集 經復旦大學附屬婦產科醫院倫理委員會批準及患者本人知情同意，絨毛組織取自年齡在25～35歲、孕7～12周自愿行人工流產術終止妊娠的正常妊娠婦女和USA婦女。正常妊娠入選標準為超聲檢查宮腔內孕囊見原始心管博動，未見盆腔積液；既往無自然流產、死胎、死產史，無遺傳、解剖、內分泌方面的異常、感染及抗磷脂綜合征。本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產癥狀和體征。USA入選標準為超聲檢查宮腔內見孕囊，未見胚芽或原始心管搏動；既往流產次數≥2次，流產時間為孕7～12周；排除母體染色體、生殖道解剖、內分泌方面的異常，生殖道感染，血栓形成傾向以及男方精液方面的異常。

1.2 主要試劑 MatrigelTMBasement Membrane Matrix 購自BD Bioscience；小鼠抗人CD147單克隆抗體購自Abcam；小鼠抗人細胞角蛋白7(cytokeratin 7，CK7)和波形蛋白(vimentin)單克隆抗體、小鼠IgG、通用ABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司；RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒、CD147及GAPDH的引物購自TaKaRa；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白上樣緩沖液購自杭州碧云天生物科技有限公司；小鼠抗人GAPDH抗體購自Santa Cruz；標記辣根過氧化物酶的羊抗小鼠IgG II 抗購自上海康成生物公司；SuperECL Plus發光液購自Thermo Scientific。

2 方法

2.1 免疫組織化學分析絨毛組織CD147的表達 絨毛組織石蠟切片常規脫蠟、抗原修復、滅活內源性過氧化物、封閉后，滴加小鼠抗人CK7、CD147單克隆抗體及小鼠IgG(1∶50)，4℃孵育過夜；次日按試劑盒說明依次加入生物素化II抗、辣根過氧化物酶標記的親和素化生物素反應試劑(ABC法)；DAB避光顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。實驗重復5次。

2.2 RT-PCR分析絨毛組織CD147的mRNA轉錄水平 早孕絨毛組織以預冷的PBS洗滌剪碎后按照TaKaRa RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，采用PrimeScriptTMRT-PCR Kit 進行逆轉錄。以上述反應所得cDNA為模板進行PCR反應(cDNA 2 μL，Premix Taq 25 μL，上、下游引物各1 μL，加DEPC水調整反應體系為50 μL)。反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，共28個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。CD147的上游引物序列為5’-GACTGGGCCTGGTACAAGATCAC-3’，下游引物序列為5’-GCCTCCATGTTCAGGTTCTCAA-3’，預計擴增產物片段長度為128 bp；GAPDH的上游引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，預計擴增產物片段長度為138 bp。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像系統記錄產物的電泳結果。用AlphaEase FC軟件對RT-PCR產物的電泳條帶進行分析。各組CD147與相應GAPDH電泳條帶的光密度比值代表其相對表達量。

2.3 Western blotting法分析絨毛組織CD147的表達水平 早孕絨毛組織以預冷的PBS洗滌剪碎后，加入適量RIPA裂解液充分勻漿，冰上放置30 min。經4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清至離心管中，用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。取50 μg 蛋白樣品加入相應體積的蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。12 000 r/min離心5 min 后上樣，進行蛋白電泳，轉膜，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，分別加入小鼠抗人CD147單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、小鼠抗人GAPDH抗體(1∶2 000 稀釋)。4 °C孵育過夜后，PBS充分洗滌，加入相應 II 抗(1∶2 000 稀釋)，室溫孵育1 h，用SuperECL Plus發光液在暗室中壓片曝光，顯影定影后膠片保存。掃描儀掃描膠片，采用Quantity One分析軟件對條帶進行密度掃描分析。2.4 滋養細胞的分離與培養 將早孕期正常絨毛組織用含抗生素的PBS充分洗滌、剪碎后采用胰酶消化和密度梯度離心兩步法分離、純化滋養細胞[8]。用此方法分離的滋養細胞經抗角蛋白和抗波形蛋白抗體免疫組織化學方法鑒定，純度達90%～95%。分離得到的滋養細胞加入含20% 胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM-high glucose培養液，種植于預先包被Matrigel的培養板，置于37 °C、5%CO2孵育箱中培養。2.5 免疫細胞化學分析滋養細胞CD147的表達 細胞生長密度約70%時，4%多聚甲醛固定20 min，1% Triton X-100通透細胞膜15 min，3% H2O2孵育15 min以去除內源性過氧化物酶的活性，含3% BSA封閉30 min。棄封閉液后，分別加小鼠抗人CK7、vimentin、HLA-G、CD147單克隆抗體及同型對照小鼠IgG(1∶50)，4 ℃孵育過夜。次日PBS浸泡3～5次后，按ABC試劑盒說明書操作，依次加入生物素化 II 抗、辣根過氧化物酶標記的生物素反應試劑，DAB避光顯色，蘇木素復染，去離子水返藍，中性樹膠封片，于Olympus倒置顯微鏡下讀片并拍照。胞漿棕褐著色者為陽性細胞，以Image-Pro Plus 6.0軟件分析染色強弱。2.6 BrdU摻入法檢測滋養細胞增殖 新鮮分離的原代滋養細胞以每孔2×104的密度種植于預先包被Matrigel的96孔板中，經無血清培養液培養12 h同步化后，加入溶媒(PBS)和抗CD147中和性抗體[9-10]。培養48 h后，每孔加入BrdU 20 μL繼續培養16 h。固定后每孔依次加入100 μL試劑盒預稀釋的BrdU抗體及羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室溫孵育，洗板，加入底物顯色后經酶標儀讀取450和590 nm雙波長的吸光度(A)值。每組設5復孔，重復3次。以處理組A值減去其空白對照之差與對照組相應A值差的比值表示增殖指數。

2.7 Transwell侵襲實驗檢測滋養細胞侵襲 將Transwell小室(8 μm孔徑、Corning)濾膜表面包被Matrigel，放入24孔培養板中，于37°C孵箱放置30 min使其凝固，使其形成上、下2個小室。上室加入新鮮分離的原代滋養細胞1×105，在下室加入600 μL含10%FBS的DMEM培養液。經無血清培養液培養12 h同步化后，加入溶媒(PBS)、抗-CD147中和性抗體[9-10](用含1% 胎牛血清的DMEM配制)。置培養板于37 °C、5%CO2培養箱中孵育48 h，以棉簽輕輕拭去上室濾膜內面的細胞，保留定向遷移至濾膜下表面的細胞。甲醇固定，蘇木素染色，置顯微鏡觀察，于高倍鏡(×200)下每孔隨機選擇5個視野拍照并計數細胞。獨立實驗重復3 次。侵襲指數為每高倍鏡視野中實驗組遷移至下表面的細胞數與對照組遷移至下表面的細胞數的比值。

3 統計學分析

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 15.0進行數據統計分析。應用配對樣本t檢驗(paired-samplet-test)或單因素方差分析(one-way ANOVA)進行2組間或多組間樣本均數的比較和統計分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 人正常早孕絨毛組織CD147的表達

對CD147在人正常早孕絨毛組織的表達進行免疫組化驗證，可見CK和CD147蛋白陽性染色呈現棕紅色，主要分布于細胞滋養層細胞；獨特型抗體小鼠IgG并未著色，表明人正常早孕絨毛組織表達CD147，見圖1。

Figure 1. The expression of CD147 in human first-trimester villous tissues (×200).

圖1 人早孕期絨毛組織CD147的表達

2 CD147在人早孕流產絨毛組織的表達水平

收集早孕期原因不明自然流產和正常妊娠婦女的絨毛組織各5例，分別通過免疫組化、RT-PCR和Western blotting法檢測CD147的表達水平。免疫組化結果顯示，流產絨毛組織滋養細胞數量明顯減少，CD147蛋白的陽性染色顆粒明顯減少。RT-PCR實驗結果顯示，流產絨毛組織CD147的mRNA水平明顯低于正常早孕絨毛組織。Western blotting實驗結果進一步驗證了上述結果，流產絨毛組織的CD147蛋白表達水平較正常早孕絨毛組織明顯下降，見圖2。

Figure 2. The expression levels of CD147 were lower in the villous tissues from the patients with early unexplained spontaneous abortion than those from the women with normal pregnancies. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal.

圖2 CD147在人早孕流產絨毛組織的表達水平下降

3 原代人滋養細胞的鑒定與CD147的表達

原代分離的早孕期滋養細胞在預先包被Matrigel的培養板上呈不規則的多邊形，喜遷移、聚集生長。細胞免疫化學結果顯示，滋養細胞CK7、HLA-G高強度著色，vimentin不著色，CD147中強度著色,表明人滋養細胞表達CD147,見圖3。

Figure 3. The expression of CD147 in the primary human trophoblasts (×200).

圖3 原代人滋養細胞CD147的表達

4 CD147抗體處理對原代人滋養細胞增殖和侵襲的影響

為進一步分析CD147是否參與調控滋養細胞的增殖和侵襲行為，我們采用抗CD147中和性抗體封閉CD147的功能，觀察原代滋養細胞增殖與侵襲能力的變化。BrdU增殖實驗結果顯示，抗CD147抗體處理滋養細胞后，細胞的增殖能力沒有明顯變化。Transwell侵襲實驗結果顯示，抗CD147抗體處理滋養細胞后，細胞的侵襲能力下降，且呈現濃度依賴趨勢，見圖4。

Figure 4. The effect of CD147 suppression by CD147 antibody on the proliferation and invasion of primary human trophoblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

圖4 CD147抗體對原代人滋養細胞增殖和侵襲的影響

討 論

妊娠初期，滋養細胞的一個重要功能就是入侵母體子宮，以提供胚胎后續發育所需要的各種營養物質。滋養細胞增生活躍，具有侵襲特性，能有效地避免機體免疫系統的攻擊，與腫瘤細胞類似，但同時受到機體精細調節系統的嚴格控制，時間限制在植入窗，空間僅限于子宮內膜和子宮淺肌層。滋養細胞的這種特殊行為對胚胎著床、胎盤發育并建立恰當的母胎關系至關重要。研究表明，滋養細胞和母體細胞可通過細胞表面分子的相互作用，調控母胎界面組成細胞的生物學行為，促進胚胎植入。CD147是細胞表面的跨膜糖蛋白，在介導細胞識別、細胞分化、組織重建等功能中起著重要的作用。CD147可以與多種細胞表面分子相結合，如親和素蛋白(cyclophilins，CyP)、單羧酸轉運蛋白(monocarboxylate transporters，MCTs)、小窩蛋白(caveolin 1，Cav-1)等，介導細胞生物學功能[11]。本研究中，我們通過免疫組化檢測也證實了CD147在人絨毛組織和原代滋養細胞有較高水平表達，可能參與調節滋養細胞的生物學行為和胚胎著床，與文獻報道一致[12]。

胚胎植入是個非常復雜的過程，起始于囊胚與母體子宮內膜黏附，直至胎盤形成。人類胚胎發育到4～6 d 形成囊胚，囊胚外圍的扁平細胞即為滋養細胞。人類胚胎在囊胚階段，CD147的表達上調[5]。早在1998年就有文獻報道[13]，CD147基因缺陷的小鼠胚胎絕大部分不能著床，繼而死亡；而同期正常小鼠胚胎的滋養層細胞高表達CD147，表明CD147在胚胎發育和植入過程中具有重要作用。但由于人類胚胎標本研究的倫理問題，CD147在人類生殖方面的功能研究鮮有報道。本研究中，我們收集正常早孕和不明原因流產婦女的絨毛組織，通過免疫組化，RT-PCR及Western blotting實驗比較CD147在2組人群中的表達差異，結果發現不明原因流產婦女絨毛組織的CD147表達水平較正常早孕婦女顯著下降，提示CD147可能參與滋養細胞生物學行為的調控，從而影響妊娠的結局。為了進一步研究CD147表達水平對滋養細胞生物學行為的影響，我們收集正常早孕自愿終止妊娠婦女的絨毛組織，分離培養得到原代滋養細胞，用不同濃度的抗-CD147抗體抑制其生物活性，分析滋養細胞增殖和侵襲能力的變化。實驗結果顯示，隨著抗-CD147抗體濃度的增加，滋養細胞的增殖指數未見明顯改變、侵襲指數顯著下降，表明CD147參與對滋養細胞侵襲行為的調控。

胚胎成功著床到建立正常母-胎血液循環，需要具有高侵襲力絨毛外細胞滋養細胞首先降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，繼而侵襲至蛻膜深部，并向子宮間質及螺旋動脈腔內呈侵襲性生長，取代子宮螺旋動脈血管內皮細胞，協助胎盤血管重鑄。MMPs在這個過程中具有重要作用。隨著胚胎著床過程的進展，MMPs尤其是MMP-2和MMP-9的表達上調，滋養細胞的侵襲力增加。而CD147能夠激活MMPs，在誘導其功能中起著重要的作用[10]。CD147還可以與整合素家族α3β1、α6β1形成蛋白復合物[11]。整合素是廣泛分布于細胞表面的跨膜糖蛋白，是一個細胞表面受體家族，屬于黏附分子大家族，能與其他細胞黏附因子相互作用，也是細胞外基質的主要受體，介導細胞黏附和細胞間信號轉導[14]。對于CD147通過何種機制和信號通路調節多種MMPs的表達和活性，進而調控滋養細胞的侵襲行為，我們仍需要進一步的研究來闡明。

綜上所述，本文研究發現CD147表達水平下降，可引起滋養細胞侵襲能力下降，進而參與不明原因自然流產的發病過程。不明原因自然流產是妊娠常見的一種并發癥，且發病率逐年升高，是導致女性不育的一個重要原因。滋養細胞生物學功能下降是導致自然流產的重要發病機制。因此，深入研究圍著床期和孕期CD147分子自身的表達調控以及其對滋養細胞侵襲行為的調控機制，可為胚胎種植失敗和自然流產的治療提供潛在的靶點。

[1] Tang Y, Kesavan P, Nakada MT, et al. Tumor-stroma interaction: positive feedback regulation of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) expression and matrix metalloproteinase-dependent generation of soluble EMMPRIN [J]. Mol Cancer Res, 2004, 2(2):73-80.

[2] Xiong L, Edwards CK, Zhou L. The biological function and clinical utilization of CD147 in human diseases: a review of the current scientific literature[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(10):17411-17441.

[3] Ferretti C, Bruni L, Dangles-Marie V, et al. Molecular circuits shared by placental and cancer cells, and their implications in the proliferative, invasive and migratory capacities of trophoblasts[J]. Hum Reprod Update, 2007, 13(2):121-141.

[4] Naruse K, Lash GB, Otun H, et al. Localization of matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9 and tissue inhi-bitors for MMPs (TIMPs) in uterine natural killer cells in early human pregnancy[J]. Hum Reprod, 2009, 24(3):553-561.

[5] Herubel F, El Mouatassim S, Guerin P, et al. Genetic expression of monocarboxylate transporters during human and murine oocyte maturation and early embryonic development[J]. Zygote, 2002, 10(2):175-181.

[6] Li W, Alfaidy N, Challis JR. Expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in human placenta and fetal membranes at term labor [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004, 89(6):2897-2904.

[7] 王永清， 宓淑芳， 李 俊， 等. 細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子在子癇前期及子癇患者胎盤組織中表達的研究 [J]. 中華婦產科雜志, 2006, 41(7):436-439.

[8] 唐傳玲， 杜美蓉， 金莉萍， 等. 環孢素A通過活化粘著斑激酶信號通路促進人滋養細胞的體外生長[J]. 生殖與避孕, 2014, 34(8):623-627.

[9] Baba M, Inoue M, Itoh K, et al. Blocking CD147 induces cell death in cancer cells through impairment of glycolytic energy metabolism[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 374(1):111-116.

[10]Dang Y, Li W, Tran V, et al. EMMPRIN-mediated induction of uterine and vascular matrix metalloproteinases during pregnancy and in response to estrogen and progesterone [J]. Biochem Pharmacol, 2013, 86(6):734-747.

[11]Iacono KT, Brown AL, Greene MI, et al. CD147 immunoglobulin superfamily receptor function and role in patho-logy[J]. Exp Mol Pathol, 2007, 83(3):283-295.

[12]Lee CL, Lam MP, Lam KK, et al. Identification of CD147 (basigin) as a mediator of trophoblast functions [J]. Hum Reprod, 2013, 28(11):2920-2929.

[13]Igakura T, Kadomatsu K, Kaname T, et al. A null mutation in basigin, an immunoglobulin superfamily member, indicates its important roles in peri-implantation development and spermatogenesis[J]. Dev Biol, 1998, 194(2):152-165.

[14]Schwartz MA, Assoian RK. Integrins and cell proliferation: regulation of cyclin-dependent kinases via cytoplasmic signaling pathways[J]. J Cell Sci, 2001, 114(14):2553-2560.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression of CD147 in villous tissues of patients with unexplained spontaneous abortion

TANG Chuan-ling1, TENG Xiao-ming1, CHE Ying1, LI Da-jin2

(1FirstMaternityandInfantHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai201204,China;2HospitalofObstetricsandGynecology,FudanUniversity,Shanghai200011,China.E-mail:djli@shmu.edu.cn)

AIM: To analyze the expression levels of CD147 in villous tissues of patients with unexplained spontaneous abortion and to investigate its biological function in human primary trophoblastsinvitro. METHODS: The villous tissues were collected from the women with normal early pregnancy and unexplained spontaneous abortion. The expression levels of CD147 were determined by immunohistochemical staining, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting. The primary trophoblasts were prepared by the trypsin-DNase I digestion and culturedinvitro. CD147 expression in the primary trophoblasts was detected by immunocytochemical staining. The primary trophoblasts were treated with anti-human CD147 neutralizing antibody, and then the cell proliferation and invasion abilities were evaluated by BrdU incorporation assay and Matrigel-coated Transwell assay, respectively. RESULTS: CD147 was expressed in the first-trimester villous tissues and human primary trophoblasts. The mRNA and protein levels of CD147 were lower in the villous tissues from the patients with unexplained spontaneous abortion than those from the women with normal pregnancies. The trophoblast invasion decreased significantly accompanied with no evident change in proliferation after treatment with anti-human CD147 neutralizing antibody. CONCLUSION: The abnormal low expression of CD147 in human villous tissues may correlate with early unexplained spontaneous abortion. CD147 plays a role in the regulation of trophoblast invasion and participates in the maintenance of successful pregnancy.

Unexplained spontaneous abortion; CD147; Trophoblasts; Cell proliferation; Cell invasion

1000- 4718(2016)11- 2067- 06

2016- 05- 25

2016- 08- 23

國家自然科學基金資助項目(No. 81300505)；國家衛生和計劃生育委員會婦幼司公益性行業科研專項衛生科研專項資助項目(No. 201402004)

R392

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.025

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△通訊作者 Tel: 021-63457331； E-mail: djli@shmu.edu.cn