槐榆煎劑對肛腸手術后大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量的影響

劉雨燕， 許向前， 羅文昭

(河南省中醫院肛腸科，河南 鄭州 450002)

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槐榆煎劑對肛腸手術后大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量的影響

劉雨燕△， 許向前， 羅文昭

(河南省中醫院肛腸科，河南 鄭州 450002)

目的： 觀察槐榆煎劑對肛腸手術后大鼠血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-10(IL-10)含量的影響，初步研究其作用機制。方法:40只Sprague-Dawley大鼠隨機分為正常對照組、模型組以及槐榆煎劑低、高劑量組，每組10只，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量；HE染色法檢測肛周組織的病理學變化；Western blotting法檢測肛周組織中細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和NF-κB的蛋白表達。結果:給予槐榆煎劑干預后，可抑制肛腸手術后大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的升高與IL-10含量的降低，減輕大鼠肛周組織的水腫及充血程度，抑制肛腸手術后ICAM-1、VCAM-1和NF-κB蛋白表達的上調。結論:槐榆煎劑可調控血清中TNF-α、IL-6與IL-10的含量，并影響肛周組織中ICAM-1、VCAM-1和NF-κB的表達。

槐榆煎劑； 肛腸手術； 炎性細胞因子

肛腸手術后創口的炎癥反應是肛門直腸疾病患者術后普遍存在的并發癥，可引發一系列次級癥狀，如排便困難或尿潴留等，給患者帶來諸多不便，影響手術效果及術后的恢復。我國肛腸疾病的發病率，女性約為67%，男性約為53.9%，各個年齡段均可發病，近年來發病率有逐漸上升的趨勢。

從槐榆煎劑(Huaiyu decoctum，HYD)的組方來看，槐花和地榆清熱解毒，涼血止血；芍藥、虎杖、蒲公英和白花蛇舌草清熱除濕，活血祛瘀，消諸瘡毒；當歸、生地和茜草清熱滋陰，涼血止血。以上諸藥相合具有清熱涼血，止血消瘡毒的功效。國內報道采用槐榆煎加減方治療內痔出血，結果顯示槐榆煎對I期內痔引起的出血的止血效果非常顯著[1]。本實驗觀察槐榆煎劑對肛腸術后大鼠血清中炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-10含量的影響，以及肛周組織細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和NF-κB蛋白表達的影響，探討槐榆煎劑對肛腸術后病理變化的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康清潔級Sprague-Dawley大鼠，40只，雌雄各半，體重為(200±20)g，購自南京君科生物工程有限公司，實驗動物使用許可證號為XYDS(滬)2013-0025，飼養于(23±2)℃室溫，自由飲食，雌雄分籠，適應性飼養1周。

1.2 實驗試劑 測定TNF-α、IL-6和IL-10的ELISA試劑盒購自R&D；抗ICAM-1、VCAM-1和NF-κB抗體購自Santa Cruz；其它試劑為國產分析純。

1.3 槐榆煎劑組方 槐花、地榆、當歸、生地各12 g，茜草、芍藥各9 g，虎杖、蒲公英各6 g，白及、白花蛇舌草、仙鶴草、荊芥穗各30 g，加水400 mL，加熱至沸，小火加熱1 h，水煎劑制成濃浸膏，參照人體用量，按系數折算出大鼠用量，加蒸餾水稀釋成灌胃溶液(含生藥200 g/L)。

2 實驗方法

2.1 肛腸手術后模型的建立 用10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)，待大鼠麻醉后仰臥，用酒精將鼠尾近端擦拭消毒，待肛門松弛后，以肛緣為界，切開皮膚至直腸黏膜，切口為三角形，底寬約1.0 cm，高約2.0 cm(皮膚破損高約0.5 cm，黏膜破損高約1.5 cm)，造成皮膚黏膜組織損傷。

2.2 分組與給藥情況 將大鼠隨機分為4組，每組10只：正常對照(normal control)組給予正常飲食；模型(model)組于建模后當天以5 mL生理鹽水灌胃；HYD低劑量組(HYD-low組)于建模后當天給予5 mL灌胃溶液灌胃，每天1次，共給藥21 d；HYD高劑量組(HYD-high組)于建模后當天灌胃5 mL灌胃溶液，每天2次，共給藥21 d。

2.3 標本的采集 各組大鼠給藥完成后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，摘取眼球取血約5 mL，靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，收集上清液置于-20 ℃冰箱中保存。各組大鼠處死后，切除肛緣直至直腸粘膜處的組織，沖洗干凈，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 ELISA檢測血清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量 按照ELISA試劑盒說明書進行操作，將各組大鼠血清加入預包被抗NSE特異性抗體的酶標板上，37 ℃溫育30 min，傾去液體，加入酶標試劑50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌，加入50 μL顯色劑A，再加入50 μL 顯色劑B，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，加入50 μL終止液，于450 nm波長處酶標儀讀數吸光度值(A)。

2.5 HE染色觀察肛周組織的病理變化 取各組大鼠肛周組織，用10%甲醛固定，常規石蠟包埋后切片，二甲苯I、II各5 min脫蠟，分別浸入梯度乙醇(100%，95%，80%，75%)，吸干水分，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅復染2 min，梯度乙醇脫水(95% 1 min×2次，100% 1 min×2次)，二甲苯透明，中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察。

2.6 Western blotting實驗 取各組大鼠肛周組織，加入RIPA裂解液裂解細胞，收集裂解液至離心管，離心后取上清液，用Bradford法進行蛋白定量，調整蛋白量。取適量裂解產物，上樣，進行SDS-PAGE。電泳結束后，轉移至PVDF膜，加入5%的脫脂奶粉的TBST溶液，室溫放置1 h，加入相應 I 抗，4 ℃孵育過夜，洗滌，加入相對應的 II 抗室溫孵育1 h，洗滌，加入ECL化學發光液孵育3 min，暗盒曝光，顯影沖洗，測定蛋白條帶的積分光密度。

3 統計學處理

所有數據采用SPSS 15.0計算軟件進行分析，實驗數據均以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。組間差異的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 槐榆煎劑對肛腸術后大鼠血清中TNF-α與IL-6含量水平的影響

如表1所示，模型組大鼠血清中的TNF-α與IL-6含量顯著高于正常對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)；與模型組相比，HYD低劑量組和HYD高劑量組大鼠血清中的TNF-α與IL-6含量顯著降低，差異有統計學顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組明顯低于HYD低劑量組。

2 槐榆煎劑對肛腸術后大鼠血清中IL-10含量水平的影響

模型組大鼠血清中的IL-10含量明顯低于正常對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)；與模型組相比，HYD低劑量組和HYD高劑量組大鼠血清中的IL-10含量顯著上升，差異有統計學顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組明顯高于HYD低劑量組，見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α與IL-6含量水平

Table 1.The content of TNF-α and IL-6 in serum of rats (ng/L. Mean±SD.n=10)

* P<0.05 vs normal control group; # P<0.05 vs model group.

3 各組大鼠肛周組織學觀察

正常對照組黏膜上皮和腺體排列整齊，未見水腫充血；模型組黏膜上皮和腺體大量缺失，黏膜下層血管充血，水腫；HYD低劑量組黏膜部分上皮和腺體缺失，黏膜下層水腫，血管充血，比模型組減輕；HYD高劑量組比HYD低劑量組病變減輕，黏膜上皮較完整，部分腺體缺失，黏膜下層水腫與充血程度減輕，見圖1。

Figure 1. The pathological changes of perianal tissue in each group with HE staining (×400).

圖1 各組大鼠肛周組織的HE染色結果

4 各組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達

如圖2所示，Western blotting實驗結果顯示模型組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達顯著高于正常對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)；給予槐榆煎劑處理后，ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達顯著低于模型組，差異有統計學顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組的蛋白表達降低幅度更大。

Figure 2. The protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in the perianal tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 各組大鼠肛周組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達變化

5 各組大鼠肛周組織中NF-κB的蛋白表達

如圖3所示，Western blotting實驗結果顯示模型組大鼠組織中NF-κB的蛋白表達顯著高于正常對照組，差異有統計學顯著性(P<0.05)；HYD低劑量組和HYD高劑量組組織中NF-κB蛋白表達顯著低于模型組，差異有統計學顯著性(P<0.05)，其中HYD高劑量組的NF-κB的蛋白表達低于低劑量組。

Figure 3. The protein expression of NF-κB in the perianal tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠肛周組織中NF-κB的蛋白表達變化

討 論

創傷或手術等造成組織的損傷，促使炎癥介質釋放，激活外周傷害性感受器，信號傳導至下丘腦和大腦皮層，通過大腦中樞神經系統對信號的整合，使人產生痛覺[2]。國外學者[3]研究發現當組織被破壞后，產生痛覺過敏介質如TNF-α、IL-6和IL-10等炎性細胞因子，這些炎性細胞因子參與組織損傷后炎癥的調控，并增加疼痛的敏感性[4]。IL-6和IL-10作為術后創傷血清中炎性和抗炎因子，可作為術后炎癥反應強烈程度的檢測指標[5]。TNF-α和IL-6屬于促炎細胞因子。研究發現TNF-α在動物模型中是致痛高敏物質，將TNF-α注射至大鼠坐骨神經軸突導致Aδ和C纖維自發放電異常，大鼠出現機械性痛覺過敏[6]。IL-6能夠刺激活化B細胞增殖，分泌抗體[7]。IL-10是一種活性較強的抗炎因子，能夠下調促炎因子受體的表達，并阻斷細胞因子的級聯反應，保護脊髓神經元，發揮鎮痛作用。報道指出IL-10可抑制致炎致痛的炎癥介質NO的合成與PEG2的產生，并通過抑制促炎細胞因子的釋放[8]，從而發揮止痛的作用。本研究發現槐榆煎劑能夠抑制肛腸病術引起大鼠血清中TNF-α、IL-6含量的升高與IL-10含量的降低，同時HE染色顯示槐榆煎劑能夠改善肛周組織充血與水腫程度，推測槐榆煎劑通過降低肛腸術后促炎因子TNF-α和IL-6的含量，進而抑制其致炎癥損傷的作用；提高抗炎因子IL-10的含量，從而降低肛腸病手術后疼痛，改善組織水腫充血的情況。槐榆煎劑可能通過抑制炎癥因子的含量，從而減少炎癥因子對外周的刺激減緩疼痛，此外，進一步減少炎癥因子作用于脊髓背角神經元NMDA受體與AMPA受體，減少神經興奮性和中樞的敏感性，從而緩解組織對刺激的疼痛反應。

黏附分子作為介導細胞與細胞間，細胞與胞外基質相互結合的細胞表面受體，主要參與細胞的識別、活化和信號轉導，在免疫應答和炎癥發生等方面具有重要作用[9]。VCAM-1通過介導單核細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞黏附至血管內皮表面，促使白細胞往炎癥部位聚集，使血管內皮細胞受損。ICAM-1介導細胞間的黏附，促使相關抗原陽性白細胞黏附于ICAM-1陽性內皮細胞表面，進一步到達炎癥組織，促進炎癥細胞的遷移和趨化[10]。NF-κB參與了許多與炎癥反應有關的基因表達調控，激活后增強各種前炎癥因子的轉錄和表達，導致細胞黏附增強、炎性細胞趨化和細胞外基質降解等[11]。ICAM-1與VCAM-1是NF-κB激活后的下游炎癥因子。本研究發現，槐榆煎劑在肛腸術后可通過抑制NF-κB通路從而減少黏膜ICAM-1與VCAM-1的表達，抑制白細胞向內皮細胞的遷移，從而抑制炎癥反應，通過抑制炎性細胞的遷移和趨化，減少炎性因子的刺激，從而緩解疼痛。

綜上所述，槐榆煎劑具有減緩肛腸術后的疼痛的作用，是通過調控炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量，抑制NF-κB通路，減少ICAM-1與VCAM-1的表達，從而抑制炎癥反應，減緩疼痛。

[1] 司紀廣. 槐榆煎加減治療內痔出血的臨床觀察[J]. 內蒙古中醫藥, 2015(6):32-33.

[2] 張莉莉， 王虎山， 姜長林， 等. 注射用帕瑞昔布鈉超前鎮痛對開腹手術病人血清白介素-6的影響[J]. 按摩與康復醫學, 2010, 1(3):6-7.

[3] Toussirot é. Biologics in spondyloarthritis: TNFα inhibitors and other agents[J]. Immunotherapy, 2015, 7(6):669-681.

[4] Esme H, Kesli R, Apiliogullari B, et al. Effects of flurbiprofen on CRP, TNF-α, IL-6, and postoperative pain of thoracotomy[J]. Int J Med Sci, 2011, 8(3):216-221.

[5] 石世堅， 何忠承， 朱元蒿, 等. 地佐辛超前鎮痛對腹腔鏡肝切除術患者血清IL-6、IL-10及術后疼痛的影響[J].中外醫療，2014(21):86-88.

[6] Wei XH, Zang Y, Wu CY, et al. Peri-sciatic administration of recombinant rat TNF-alpha induces mechanical allodynia via upregulation of TNF-alpha in dorsal root ganglia and in spinal dorsal horn: the role of NF-kappa B pathway[J]. Exp Neurol, 2007, 205(2):471-484.

[7] 沈穎潔， 劉 喆. 手術創傷應激與炎性細胞因子的相關研究進展[J]. 遼寧中醫藥大學學報，2011，13(11):75-77.

[8] Song XJ, Huang ZJ, Song WB, et al. Attenuation effect of spinal manipulation on neuropathic and postoperative pain through activating endogenous anti-inflammatory cytokine interleukin 10 in rat spinal cord[J]. J Manipulative Phy-siol Ther, 2016, 39(1):42-53.

[9] 楊 簡， 楊 俊. 細胞黏附分子和動脈粥樣硬化[J]. 醫學綜述, 2006, 12(21):1307-1309.

[10]Kim SY, Ryu HM, Yang JH, et al. Matemal serum levels of VCAM-1, ICAM-1 and E-selectin in preeclampsia[J]. J Korean Med Sci, 2004, 19(5):688-692.

[11]Pueyo ME, Gonzalez W, Nicoletti A, et al. Angiotensin II stimulates endothelial vascular cell adhesion molecule-1 via nuclear factor-kappaB activation induced by intracellular oxidative stress[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20(3):645-651.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of Huaiyu decoctum on serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in rats after anorectal operation

LIU Yu-yan, XU Xiang-qian, LUO Wen-zhao

(DepartmentofProctology,HenanProvinceHospitalofTCM,Zhengzhou450002,China.E-mail:hnszyylyy@126.com)

AIM: To investigate the effects of Huaiyu decoctum on the serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in rats after anorectal operation. METHODS: Sprague-Dawley rats (n=40) were randomly divided into 4 groups: normal group, model group, low-dose Huaiyu decoctum group and high-dose Huaiyu decoctum group. The concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10 in the rat serum were measured by ELISA. The pathologic changes of the anorectal tissues were observed under microscope with HE staining. The protein expression of ICAM-1, VCAM-1 and NF-κB was determined by Western blotting. RESULTS: After Huaiyu decoctum administration, TNF-α and IL-6 concentrations in the serum were significantly decreased, and IL-10 concentration was increased as compared with model group. Moreover, Huaiyu decoctum markedly attenuated edema and hyperemia in the rats after anorectal operation. The protein expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and NF-κB in the anorectal tissues was obviously inhibited by Huaiyu decoctum treatment. CONCLUSION: Huaiyu decoctum improves the recovery of anorectal tissues after operation by decreasing the serum concentrations of TNF-α, IL-6 and IL-10, and reducing the protein expression of ICAM-1, VCAM-1 and NF-κB in the anorectal tissues.

Huaiyu decoctum; Anorectal operation; Inflammatory cytokines

1000- 4718(2016)11- 2091- 04

2016- 05- 23

2016- 08- 29

R259; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.030

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