谷朊粉糖基化改性對其結構及溶解性的影響

宋永令 李江河 王若蘭

(河南工業大學糧油食品學院；糧食儲藏與安全教育部工程研究中心；糧食儲運國家工程實驗室，鄭州 450001)

谷朊粉糖基化改性對其結構及溶解性的影響

宋永令 李江河 王若蘭

(河南工業大學糧油食品學院；糧食儲藏與安全教育部工程研究中心；糧食儲運國家工程實驗室，鄭州 450001)

本試驗使用葡聚糖對谷朊粉進行干法糖基化改性。研究了反應溫度、時間以及糖與谷朊粉的配比對反應接枝物溶解度的影響，優化了制備最佳溶解度接枝物的工藝條件。同時研究了接枝物在不同pH以及溫度條件下的穩定性。并通過傅里葉紅外光譜(FTIR)和電子顯微鏡(SEM)掃描方法證實了糖基化的發生及糖蛋白結構的變化。結果表明，在反應溫度59 ℃，葡聚糖/谷朊粉(m/m)280%，反應時間12 d(288 h)的條件下接枝物的溶解度最高，為1.923 mg/mL。在pH較高或較低以及谷朊粉等電點等情況下，接枝物的功能特性均處于較高水平，且具有良好的穩定性。通過紅外掃描分析可知，改性后蛋白質的二級結構發生了很明顯的改變，其β折疊有所減少，α螺旋、轉角結構的含量得到一定程度的增加，而糖基化改性對無規則卷曲結構的影響不大，通過電鏡掃描分析可知，糖基化改性后蛋白質的分子體積增大。

谷朊粉 葡聚糖 干法糖基化 溶解度

谷朊粉又稱活性小麥面筋，作為小麥加工生產淀粉的副產物，每年都有大量的谷朊粉產生。由于其適中的價格，作為蛋白質資源它常常與牛奶和大豆蛋白成為競爭對手[1]。目前，谷朊粉廣泛用于固體食物，但在液體食品(如飲料、奶制品)中的應用是有限的。這主要是由于谷朊粉富含疏水性氨基酸(如谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸)，導致蛋白質結構中有較大的疏水區。因此，谷朊粉的溶解性、乳化性及發泡性不能滿足食品加工的需求。而溶解性是蛋白質的重要性能之一，它可能會影響蛋白質的其他功能特性，如乳化性、凝膠性等。因此，改善谷朊粉的溶解特性，拓寬其應用范圍具有重要的意義。

通過美拉德反應制備蛋白-多糖復合物是改善蛋白質功能特性的一項新方法，此方法具有反應條件溫和、不添加其它化學試劑等優點。目前對于蛋白質-多糖復合物在提高蛋白質的溶解性，乳化能力和乳化穩定性等方面已有研究報道。布冠好等[2]研究發現，通過糖基化修飾大豆蛋白后，其功能特性包括溶解性、乳化特性、凝膠特性、熱穩定性及過敏原性均有所改善。趙艷娜等[3]的研究也發現，乳清蛋白與乳糖結合后，其抗氧化能力有了大幅度的提高，甚至其還原能力還要高于VC和BHA。任仙娥等[4]分別采用3種不同的糖對谷朊粉進行濕法糖基化改性。結果表明，改性后谷朊粉的溶解性、乳化性、表面疏水性均有不同程度的提高。

蛋白質常用的糖基化方法主要有2種：干法和濕法。濕熱法較干熱法相比，條件相對簡單，反應速率快，主要用于蛋白質與單糖或雙糖的接枝反應，而與多糖進行反應的報道相對較少，有研究表明，多糖的加入較單糖與雙糖更能提高蛋白質的功能性質[5]。本研究采用干法來制備谷朊粉與葡聚糖的糖基化接枝產物，優化制備具有較好溶解性的糖基化反應條件，并對改性的機理進行了初步探究，旨在拓寬谷朊粉改性的途徑，為植物蛋白的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試驗原料

谷朊粉：封丘縣華豐粉業有限公司；葡聚糖(AR)：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 主要試驗儀器及設備

TU-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Hitachi S-4300掃描電鏡 ：日本日立公司；WQF-510傅里葉紅外光譜儀：美國Thermo Nicolet公司；LGJ-10C型冷凍干燥機：北京市四環科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 接枝物制備[6]

稱取一定量的谷朊粉，溶于pH為12的磷酸緩沖溶液中，使其濃度為10 mg/mL。以一定比例將谷朊粉與葡聚糖(m/m)進行混合，振蕩直至溶解完全。對混合液進行冷凍干燥，然后把得到的樣品放置在底部為飽和KBr溶液的密封干燥器內(相對濕度為79%)，再分別放置在不同溫度的恒溫箱內反應，定時取樣。得到的反應產物放入冰箱內冷凍保存，待測。

1.3.2 溶解度測定[7-8]

a.雙縮脲試劑配制：取1.5 g CuSO4·5H2O和6.0 g酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·4H2O)，用500 mL蒸餾水溶解，在攪拌下加入300 mL的10%NaOH (m/V)，用水稀釋到1 000 mL，貯存于塑料瓶中(或內壁涂有石蠟的玻璃瓶中)。

b.蛋白質溶解度的測定：配制1%(m/V)接枝物溶液，平衡30 min，在離心機上以3 000 r/min 離心10 min。靜置，取上清液1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，劇烈振蕩10 min，靜置放置30 min。取1個試管先加入1 mL蒸餾水，再加入4 mL雙縮脲作為空白試驗，于540 nm處進行比色測定，以牛血清蛋白的溶解度作標準曲線。

c.牛血清蛋白溶解度標準曲線的繪制：配制濃度為20 mg/mL的牛血清蛋白標準溶液，并分別移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于試管中，不足1.0 mL者用蒸餾水補齊至1.0 mL。再將各試管中加入4.0 mL雙縮脲試劑，然后用上述蛋白質溶解度的測定方法分別測定其吸光值。以牛血清蛋白濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，做標準曲線，方程為y=0.049x+0.002，相關系數R2為0.998。

1.3.3 接枝產物在不同pH條件下的穩定性

將制備的接枝物溶于去離子水，使其質量濃度為5 mg/mL。然后用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液來調節溶液pH，使其值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，再測定接枝物的溶解度隨pH的變化。

1.3.4 接枝產物在不同溫度條件下的穩定性

將接枝物溶于去離子水，使其濃度為5 mg/mL，然后將其放到水浴鍋中，使其溫度為30、40、50、60、70、80、90 ℃，再分別測定接枝物的溶解度隨溫度的變化。

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析[9]

先將谷朊粉以及接枝物進行充分干燥，再將樣品與KBr質量比為1:300的比例進行混合，充分碾磨，壓制成薄片。利用紅外光譜儀做全波段掃描(400～4 000 cm-1)，掃描12次。

1.3.6 掃描電鏡分析[10]

對谷朊粉以及接枝物進行充分干燥，取少量的樣品粘貼到樣品臺的導電膠上，真空條件下在導電膠表面噴金，利用掃描電鏡進行觀察。

2 結果與分析

2.1 干法糖基化反應的單因素研究

以葡聚糖為糖基供體，分別對反應溫度、反應時間、蛋白多糖比例進行單因素試驗，根據糖基化谷朊粉溶解性的高低初步確定反應條件。

2.1.1 反應溫度對接枝物溶解度的影響

如圖1所示，糖基化谷朊粉溶解性隨反應溫度升高呈現先增加后降低的趨勢，反應溫度對糖基化產物具有顯著影響，當反應溫度為60 ℃附近時接枝物的溶解度最高。糖基化是在蛋白質氨基酸側鏈上引入糖基，一方面糖基的引入增加了蛋白質中親水性基團的數量，從而使蛋白質達到更好的親水親油性的平衡，另一方面，糖基的引入可以阻礙蛋白質分子聚集，從而提高蛋白溶解性。在一定范圍內隨反應溫度升高，谷朊粉與糖共價交聯速度加快，蛋白質結構展開，提高大分子表面活性，增加接枝物親水性，從而提高其溶解性；但當反應溫度繼續升高超過一定程度時，蛋白質開始聚集變性，分子中部分親水性基團被覆蓋，導致接枝物的溶解性開始下降。張波等[11]在對糖基化對大豆蛋白乳化性研究結果中顯示溫度達到一定程度時，其復合物的乳化性也會出現下降趨勢，此結果與本研究相一致。

圖1 不同反應條件對接枝物溶解度的影響

2.1.2 葡聚糖/谷朊粉對接枝物溶解度的影響

蛋白和多糖的分子間共價結合是在一定的基團間進行的，適當的反應物配比不僅可以提高反應的速度和最終的反應程度，而且還可以減少副反應(如焦糖化)的發生[11]。圖1顯示出，葡聚糖/谷朊粉對接枝物的溶解性的影響比較明顯。葡聚糖/谷朊粉(m/m)質量比小于275%時，隨著葡聚糖的增加，接枝物的溶解性不斷增加，大于275%時，溶解性開始下降。這可能是由于糖比例的增大提高了蛋白質自由氨基與糖分子還原末端的羰基之間的接觸幾率，接枝度升高；然而，隨著糖含量的繼續增加，溶液的黏度增加和空間位阻效應明顯，接枝度降低。王成波[12]在對玉米谷蛋白-葡萄糖復合物溶解性研究結果也顯示，谷蛋白/葡萄糖質量比并不是越大越好，而是有一個最佳的值。那治國等[13]以米糠谷蛋白和葡聚糖為原料進行干法糖基化改性，研究表明蛋白/糖為1∶5時，反應得到的復合物的接枝度最高。

2.1.3 反應時間對接枝物溶解度的影響

如圖1曲線所示，反應時間對枝結物溶解性的影響比較明顯。隨著反應時間的延長，枝結物的溶解性逐漸增加，反應時間為10 d時，接枝物的溶解性最好。但是反應時間超過10 d之后，枝結物的溶解性開始下降，這種變化趨勢與王成波[12]研究玉米谷蛋白-葡萄糖復合物溶解性的變化相一致。這是因為隨著反應時間的延長，糖基化反應比較充分，但是時間太長美拉德反應的一些中間產物可能會抑制該反應的進行，溶解性反而不是很好。

2.1.4 響應面法優化制備最佳溶解度接枝物的工藝條件

根據上述單因素試驗結果與實際生產要求選取合適的因素水平，并根據螺旋中心組合設計原理，采用軟件 Design Expert 7.1中Box-Behnken模型對反應條件進行優化，各因素水平編碼表如表1所示。

表1 三因素三水平響應面分析水平編碼表

接枝物溶解度的試驗結果見表2。其中所得數據均為3次重復試驗的平均值。

利用分析軟件對表2中的數據進行回歸分析，得出了葡聚糖和谷朊粉接枝物溶解度(Y)與反應溫度(X1)、谷朊粉與葡聚糖配比(X2)、反應時間(X3)的回歸方程。

表2 試驗結果

接枝物：Y=+1.87-0.077×X1+0.10×X2+0.29×X3-0.10×X1×X2-0.14×X1×X3-0.035×X2×X3-0.40×X12-0.49×X22-0.44×X32

表3為所建回歸方程的方差分析。表中，葡聚糖與谷朊粉的接枝物溶解度回歸方程模型F檢驗極顯著(P<0.01)，表示所建模型與試驗數據擬合良好，試驗誤差較小。而所建模型的失擬P值均大于0.05，不顯著，表明其它因素對所建模型的影響較小，能充分反映各反應因素之間的關系以及數據的情況。所以建立的模型可以對試驗進行準確的分析和預測。

表3 葡聚糖接枝物溶解度方差分析

注：P<0.01 極顯著(**)；P<0.05 顯著(*)；P>0.05 不顯著。

圖2 葡聚糖接枝物溶解度兩因素交互響應面分析

為了更直觀地表現2個因素同時對接枝物溶解性的交互作用，根據回歸方程，作出響應面立體圖，運用SAS 軟件對二次回歸模型進行規范分析，以任意2個因素為考查對象，剩余1個因素水平值取為0，進行降維分析，得到二元二次方程繪出響應面圖及等高線圖形，如圖2所示。

由圖2可以看出，具有較好溶解度的葡聚糖與谷朊粉接枝產物的反應時間集中在零水平后，而反應溫度以及葡聚糖/谷朊粉集中在零水平附近。葡聚糖與谷朊粉反應需要較高的溫度以及較長的時間，這是由于葡聚糖的分子量太大造成的。從等高線圖中可以看出，反應溫度與葡聚糖/谷朊粉，反應溫度與反應時間的交互作用不顯著，反應時間與葡聚糖/谷朊粉的交互作用顯著。同時，有利于葡聚糖與谷朊粉糖基化接枝物溶解度的反應溫度范圍為：57～62 ℃；葡聚糖/谷朊粉范圍為：250%～310%；反應時間范圍為：9～15 d。各因素對接枝物溶解度影響的大小順序為：反應時間﹥葡聚糖/谷朊粉﹥反應溫度。

2.1.5 工藝優化及試驗驗證

根據響應面條件的優化，得出葡聚糖與谷朊粉糖基化反應的最佳條件為：反應溫度59.13 ℃，葡聚糖/谷朊粉 (m/m)283.17%，反應時間11.75 d，此時的溶解度為1.93 mg/mL。根據實際將條件設定為反應溫度59 ℃，葡聚糖/谷朊粉(m/m)280%，反應時間12 d(288 h)。

將優化后設定的實際反應條件做3組平行試驗得到表4，從表中可以看出各糖接枝物溶解度的平均值與理論值之間的誤差均小于1%，說明了優化條件的準確性。

表4 接枝物溶解度試驗驗證表

2.2 接枝產物在不同pH及溫度條件下溶解度的穩定性

2.2.1 接枝產物在不同pH條件下溶解度的穩定性

由圖3可知，在pH 3～12的范圍內，干法糖基化復合物的溶解度都有提高，谷朊粉的等電點附近(pH 為7～8)時，谷朊粉的溶解度只有0.4 mg/mL左右，而糖基化接枝產物的溶解度均達到2.0 mg/mL以上，提高非常顯著。這主要是由于多糖鏈的引入，使得蛋白的親水基團數量大大增加，蛋白質的溶解度得以顯著改善；另一方面，隨著pH值的變化，接枝物溶解度變化比未糖基化谷朊粉溶解度的變化要相對平緩，這說明糖基化改性能提高接枝物的抗酸堿能力。

圖3 pH對接枝物溶解度的影響

2.2.2 接枝產物在不同溫度條件下溶解度的穩定性

溫度條件在一定范圍內對谷朊粉的溶解性起到促進作用，這是由于在適當范圍內升高溫度有助于蛋白質分子結構的展開，提高蛋白質分子的分散能力，從而提高其溶解度。但是隨著溫度的增加，蛋白質分子過分展開，大量疏水性氨基酸暴露出來，使蛋白質的溶解度有下降的趨勢[14]。圖4為谷朊粉和接枝物溶解性隨溫度的變化。可以看出，谷朊粉在溫度達到60 ℃附近時，其溶解性開始下降，說明蛋白質開始變性，70 ℃附近時，蛋白質變性嚴重，蛋白質分子間聚集沉淀導致其溶解度急劇下降。接枝物在70 ℃附近時，溶解度開始出現下降，這說明接枝物的變性溫度推遲，而且與未糖基化的谷朊粉相比，其溶解度下降比較緩慢，這可能是由于葡聚糖具有大分子的空間穩定作用，使得蛋白分子受到阻礙，不易靠近而聚集沉淀，使其溶解度下降比較緩慢。這說明糖鏈的接入提高了蛋白質的熱穩定性。徐彩虹[15]研究發現，大豆 7S 球蛋白經過糖基化后熱變性溫度得到了提高，此結論與本研究結果相一致。

圖4 溫度對接枝物溶解度的影響

2.3 紅外分析

傅里葉紅外光譜是常用的分析蛋白質結構的方法之一，可以靈敏反映出肽鏈結構的變化。圖5為通過傅立葉紅外掃描后可得到谷朊粉和接枝物的紅外圖譜。蛋白質與多糖分子以共價鍵接枝后，一個典型的特征就是蛋白質分子的羥基含量增加，在紅外光譜表現為羥基的特征吸收增強[16-17]。羥基的特征吸收峰有2個，分別是—OH伸縮振動吸收峰(3 700～3 200 cm-1)和伸縮振動吸收峰(1 100～1 000 cm-1)，接枝產物和未糖基化的谷朊粉在3 700～3 200 cm-1和1 100～1 000 cm-1處都有較強的吸收，但接枝物吸收強于谷朊粉，由此可以說明由于葡聚糖糖鏈上存在多個羥基，其通過共價鍵接入谷朊粉肽鏈上后，增加了肽鏈中羥基數量。

圖5 谷朊粉及葡聚糖接枝物紅外圖

蛋白質的紅外光譜圖譜有幾組特征吸收譜帶：酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶，其中能夠反映蛋白質二級結構變化的為酰胺Ⅰ區1 600～1 700 cm-1范圍[18]。其中β折疊的吸收峰處于1 600～1 640 cm-1之間，而無規則卷曲的吸收峰在1 640～1 650 cm-1之間，處于1 650～1 670 cm-1的吸收峰代表為α 螺旋的存在，1 680～1 685 cm-1之間的吸收峰可以反映出轉角結構。對所得的光譜圖利用軟件PeakFit依次進行去卷積、分峰、擬合處理，得到酰胺Ⅰ帶的紅外擬合曲線圖6。再根據不同峰所反映出的結構，計算峰面積，得到各結構所占蛋白質二級結構的比重如表5所示。

圖6 谷朊粉及接枝物酰胺Ⅰ帶紅外擬合曲線

結構類型二級結構中的占比/%谷朊粉葡聚糖接枝物β折疊結構37.9433.03無規則卷曲14.2713.07α螺旋結構25.7027.73轉角結構22.0926.17

由表5可以看出，經過干法糖基化改性以后，接枝物的二級結構中β折疊結構含量減少，α螺旋結構含量少量上升，蛋白質的轉角結構含量也有一定的提高，同時對比蛋白的無規則卷曲比例，發現改性前后差別不大。總體來說，糖基化改性后，蛋白質的有序結構增加。這一研究結果與布冠好等[19]研究大豆蛋白-葡萄糖復合物的抗原性及結構特性時所得結論一致。理論上蛋白質在加熱過程中，蛋白質肽鏈受到熱振蕩，保持蛋白質空間結構的次級鍵主要是氫鍵被破壞，分子內部有序排列被解除，從而導致蛋白質分子結構的展開，會使蛋白質的無序結構增加。但是糖基化反應條件溫和，溫度較低，并沒有使蛋白質肽鏈受到過分的熱振蕩，無規則卷曲比例增加并不明顯。同時，從圖6酰胺Ⅰ帶的紅外擬合曲線圖可以看出，接枝物與谷朊粉相比，在1 600～1 640 cm-1區間，在相同波數時，接枝物的吸收峰普遍高于谷朊粉，而在1 650～1 685 cm-1區間，在相同波數時，接枝物的吸收峰則普遍比谷朊粉低，這說明蛋白質二級結構的 β-折疊有部分轉化為 α-螺旋結構或轉角結構。徐彩虹[15]在研究大豆球蛋白糖基化枝接改性及其熱聚集行為時，得出相似的結論。

2.4 電鏡掃描

經掃描電鏡對接枝物以及谷朊粉進行掃描后的到圖7。

a葡聚糖接枝物 b谷朊粉

圖7 谷朊粉及接枝物的掃描電鏡圖

圖7可以看出，谷朊粉和干法接枝物的微觀結構明顯不同。通過同等倍數放大后可以看出，谷朊粉的微觀結構為小粒狀，分子之間結合程度低，分子體積較小。對比谷朊粉而言，接枝物的分子間發生大量的結合聚集現象，接枝物呈大塊狀。這也說明了接枝反應后，葡聚糖與谷朊粉相結合，從而將谷朊粉分子團團圍住，形成了體積更大的接枝物分子。這與管軍軍等[20]以及那治國等[13]的研究結果一致。

3 結論

單因素試驗結果表明，反應溫度、反應時間、谷朊粉/葡聚糖的質量比均對制備接枝物的溶解性影響顯著(P<0.01)。

研究了反應溫度、時間以及糖與谷朊粉的配比對反應接枝物溶解度的影響，并利用Box-Behnken模型對反應條件進行了優化，方差分析表明所建模型與試驗數據擬合良好，試驗誤差較小。通過對模型的驗證，最終獲得溶解性最好的反應條件為：溫度為59 ℃，葡聚糖/谷朊粉為280%，反應時間為12 d(288 h)，此時溶解度為1.923 mg/mL。

考察了糖基化接枝物在不同pH值和不同溫度條件下穩定性，研究結果顯示，谷朊粉等電點、谷朊粉溶解性下降迅速，而接枝物的下降相對緩慢；隨著溫度的升高，接枝物表現出很好的熱穩定性。

紅外光譜分析一方面證明了美拉德反應的發生，另一方面表明糖鏈的加入使蛋白質分子的空間結構發生改變，改變谷朊粉的溶解特性。掃描電鏡顯示，谷朊粉和接枝物的微觀結構明顯不同，谷朊粉呈現小粒狀，而接枝物由于多糖的引入，使得蛋白分子結構變大，呈大塊狀。

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Structure and Solubility of Gluten-Polysaccharide Conjugates

Song Yongling Li Jianghe Wang Ruolan

(School of Food Science and Technology Engineering Research Center of Grain Storage and Security of Ministry of Education Grain Storage and Logistics National Engineering Laboratory, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001)

In this experiment, the modification of gluten via dry-heated Maillard reaction with dextran was studied. The effects of reaction temperature, time and the ratio of sugar to gluten on the solubility of the protein-polysaccharide conjugates were studied, and the process conditions for the preparation of glycoprotein with optimum solubility were optimized. The stability of the protein-polysaccharide conjugates at different pH and temperature was also studied. The glycosylation actions and the structure changes of the protein-polysaccharide conjugates were confirmed by infrared spectroscopy (FTIR) and scanning electron microscopy (SEM). The results showed that the solubility of the protein-polysaccharide conjugates was highest of 1.923 mg/mL under the reaction condition of the temperature 59 ℃, time 12 d(288 h) and dextran/gluten(m/m)280%. The functional properties of the modified protein were in a high level, and had good stability in the case of pH higher or lower, as well as the isoelectric point of gluten. The infrared spectroscopy showed the structure of the modified protein had a very obvious change, including the decrease of β-fold, the increase of α-helix and β-turn structure at a certain degree. But the glycosylation had little effect on the Irregular coiled structure. The scanning electron microscopy showed that the volume of modified protein was increased.

gluten, Dextran, dry glycosylation, solubility

TS21

A

1003-0174(2016)12-0125-08

河南工業大學校高層次人才基金(2012BS023)，河南省高等學校重點科研項目(15A550001)

2015-05-22

宋永令，女，1981年出生，講師，糧食儲藏理論與技術