東方百合“甜夢”花器官組織培養再生植株研究

農艷豐　楊美純　寧云芬　周珊

摘要：研究東方百合“甜夢”品種花器官的組織培養，為“甜夢”百合種球生產產業化提供技術支持。以“甜夢”花器官為外植體誘導愈傷組織，以MS添加不同濃度6-BA為愈傷組織分化培養基，MS添加不同濃度6.BA及NAA配比為誘導葉片產生不定芽的培養基，MS添加不同濃度糖為結鱗莖培養基，進行組織培養。結果表明：花器官不同部位誘導愈傷組織從易到難為：子房>花柱>花藥>花托；愈傷組織分化以MS+6.BA 3.0 mg/L培養基較適宜；無菌葉片誘導不定芽以MS+6.BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養基為好；添加60 g/L糖的培養基利于不定芽結鱗莖生根；帶鱗莖組培苗可直接移栽于大田菜園土。通過“甜夢”花器官的培養，得到可用于生產的組培苗，該技術可應用于“甜夢”百合種苗工廠化生產。

關鍵詞：東方百合 “甜夢” 組織培養 花器官培養

百合（Lilium spp.）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生具地下鱗莖的草本植物，具有很高的觀賞價值和經濟價值。目前鮮花市場上流行的觀賞百合有四大品系（鐵炮系、亞洲系、東方系、L/A系），東方百合系列種植面積最大。“甜夢”屬于東方百合的1個品種，其花色粉紅，香氣宜人，是近年進口花卉品種之一。百合組織培養中常用的方法是以百合鱗片作為外植體，用0.1%升汞溶液滅菌時間較長，而污染率相對較高。近年來以花器官為外植體進行培養的報道，主要以亞洲百合為主，花器官以花托、子房、花柱的分化率較高，較適宜的培養基是6-BA與NAA的配合使用。其次為東方百合，趙得萍對東方百合Sorbonne花器官進行的培養則花萼、花絲、花瓣均有較高的分化率。劉雅莉以Sorbonne花器官進行培養則直接誘導出不定芽。楊美純等以“馬可波羅”品種花器官為外植體，以花托誘導率為100%最高。王月等采用“梯伯”品種的再生植株嫩葉建立無性體系，張延龍則直接以“西西”品種葉片為外植體誘導愈傷組織，但誘導率不高。試驗在前人的研究基礎上，以東方百合“甜夢”花器官為外植體，建立其再生植株快速繁育體系，以期為百合的種苗工廠化生產充實理論依據。

1.材料與方法

1.1試驗材料

東方百合“甜夢”品種花朵。

1.2試驗方法

1.2.1滅菌及初代培養

選取花蕾和半開的花朵作為外植體進行滅菌。在超凈工作臺上將花蕾用75%酒精擦拭，0.1%HgCl2滅菌5 min；半開的花朵用洗衣粉溶液浸泡5min，自來水沖洗30 min，在超凈工作臺上用75%酒精滅菌50 s，0.1%HgCl2滅菌5 min，把滅菌過的外植體的花藥、花托、柱頭、子房等部位切開，分別接種于MS+6.BA 3.0 mg/L的培養基中誘導愈傷組織，6 d后統計污染數和死亡數。

1.2.2愈傷組織分化培養

把花器官各部分培養所獲得的愈傷組織切成直徑約0.6 cm的小塊，接種于MS添加不同濃度6-BA（0-3.0 mg/L）的分化培養基中。30 d后統計分化出的不定芽數。

分化率=分化出不定芽的愈傷組織數/接種愈傷組織總數×100。

1.2.3不定芽葉片誘導分化培養

把由愈傷組織產生的不定芽葉片切成1 cm長度的小段，接種于培養基上，30 d后統計誘導率。

1.2.4不定芽結鱗莖及生根培養

選取生長健壯的單株不定芽接種到不同糖濃度的MS培養基中，30 d后統計生根、結鱗莖情況。

1.2.5組培苗移栽

選取具有根及鱗莖（直徑1 cm左右）的組培苗移出培養室，在大棚煉苗3 d后，洗凈培養基，分別種在大棚內沙床和室外菜地，每個處理種30株，1個月后統計成活數和新長出的根數。

1.3基本培養基及培養條件

基本培養基為MS，pH值5.8-6.0。光照強度2000-3000 Lx，光照時間為12-14 h/d，溫度為26-28℃。

2.結果與分析

2.1花器官的培養

由表1可看出，經過不同方式的滅菌后，總體污染率大部分為0，只有花蕾有少量的污染。存活的花藥培養13 d后開始膨大，之后慢慢變綠。花蕾的花托和子房在培養12 d后開始膨大，15 d后花柱也開始膨大，膨大后的子房顏色變綠。半開花朵的花器官培養中，子房比花蕾的子房推遲2 d膨大，有一端可觀察到有5-6粒似胚狀體小顆粒，柱頭也開始膨大。在培養40 d之后，子房、花柱和花藥均誘導出愈傷組織。花器官中以子房的誘導率最高，可達83.3%。

2.2 6-BA對愈傷組織分化的影響

由花器官誘導得到的愈傷組織經過多代增殖培養后，得到緊致、表面有綠色顆粒狀的愈傷組織，接種于添加6-BA的分化培養基中。如表2所示，在6.BA人工激素的刺激下，愈傷組織的分化率最高達100.0%：在0-3.0 mg/L濃度之間，隨著6.BA濃度的增大，愈傷組織分化率逐漸升高，且愈傷組織的分化率均高達70.0%以上；6-BA在3.0mg/L濃度時，平均每團愈傷組織分化出的不定芽數最多，有3.0個。在試驗中也觀察到，在愈傷組織分化中，一部分的不定芽基部直接形成鱗莖。

2.36-BA和NAA配比對誘導葉片分化不定芽的影響

由表3所示，在添加6.BA的處理中1.0-3.0mg/L各組的分化率均比CK高，以6.BA 2.5 mg/L處理的為最高，達50.0%；在6.BA和NAA配比的處理中，分化率相對較高，平均出芽數也相對較高，以6.BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理為最好，分化率達65.0%，平均出芽數為0.9個。在試驗過程中發現，不定芽葉片基部比較容易分化出芽，葉片中部較少分化，葉片頂端則幾乎不分化而死亡。因為接種葉片的部位是隨機的，因此平均出芽數都相對較低。綜合各方面的因素考慮，在無菌葉片的誘導分化中以MS+6.BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養基為好。

2.4糖濃度對不定芽結鱗莖生根的影響

將不定芽接種到添加不同糖濃度培養基中，發現一定濃度的糖容易誘導百合不定芽基部膨大結鱗莖。含有低濃度糖的處理中，不定芽結鱗莖較少，只有一半可以結鱗莖；在糖濃度超過60 g/L的處理中不定芽結鱗莖多達80%左右，鱗莖最大直徑可達1.2 cm。同時隨著糖濃度的增高，不定芽生根率隨之增大至100%，平均根數先升高后有所下降，其中以60 g/L糖濃度的培養基的生根率（100.0%）和平均根數（6.9條/個）達到最大值。綜合不定芽結鱗莖和生根考慮，培養基以添加糖濃度60 g/L的MS培養基為宜。

2.5基質對帶鱗莖的組培苗移栽的影響

已生根的百合鱗莖分別移栽在露天菜園土及大棚中按3：1沙床和土的混合基質中，隔1 d澆1次水，1周后施復合肥，1個月后統計其生長情況。由表5結果可看出，種于大棚混合基質中的鱗莖周徑變小，成活率低，原先在培養基中生長的根都枯萎同時均無生長新根，可能是因為沙床營養不足，保水性差，鱗莖無法吸收足夠的養分和水分，導致鱗莖萎縮，根活力降低。而種于菜園土的百合鱗莖移栽后周徑有所增長，100%成活，重新長根的鱗莖高達90%以上，在試驗觀察中還發現，有些鱗莖已經開始生長新葉片，葉片肥厚濃綠。因此，“甜夢”組培鱗莖煉苗后可直接移栽于大田菜園土中。

3.討論

劉麗敏采用不同百合花器官的不同部位進行組織培養，發現不同品種百合誘導愈傷組織的難易程度不同。試驗中“甜夢”品種不同部位誘導愈傷組織從易到難為：子房>花柱>花藥>花托。以花蕾或半開狀態的花朵為外植體，比較容易滅菌，污染率低，可能因為花蕾或半開狀態的花內部處于較封閉狀態，雜菌很難進入。6-BA對愈傷組織的分化有較顯著的效果，分化率最高達100%，鱗芽質量較好。以不定芽葉片切段進行再培養，可誘導不定芽分化，其中以葉片基部較容易誘導出芽和愈傷組織，這與王月的研究結果一致。采用此方式增加了百合組織培養的快速繁殖途徑。誘導百合不定芽結鱗莖生根的方式有多種，王和飛的研究表明，基本培養基1/2 MS和MS對百合生根均有促進作用，生長素2，4-D、IBA、NAA均對百合鱗莖生根有顯著的促進作用。而本試驗選擇不同糖濃度誘導“甜夢”不定芽結鱗莖生根有顯著的效果。劉雅莉等選擇珍珠巖、河沙、營養土等混合基質來移栽百合鱗莖，本試驗則采用直接種植于大田菜園和沙與土按比例混合的基質，結果表明，“甜夢”組培鱗莖煉苗后可直接移栽于大田菜園土中，可能是因為菜園地能夠提供充足的水分和養分，利于移栽鱗莖的吸收，從而利于百合鱗莖的成活和生長。“甜夢”帶鱗莖的組培苗移栽大田適應性較強，在生產中可直接在大田種植。

4.結論

試驗中“甜夢”品種花器官不同部位誘導愈傷組織從易到難為：子房>花柱>花藥>花托。6-BA3.0 mg/L可直接作為誘導花器官產生愈傷組織的培養基，并對愈傷組織的分化有顯著的誘導效果，分化率最高達100%，鱗芽質量較好。在無菌葉片誘導不定芽中以MS+6.BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養基為好。不同糖濃度誘導不定芽結鱗莖最高達80%左右，鱗莖最大直徑可達1.2 cm。生根率可達到75.0%以上，根青綠色，粗壯。試驗可為“甜夢”百合品種的種苗工廠化生產充實理論依據。