玻璃酸鈉和Omega-3必需脂肪酸混合滴眼液對去勢雄兔干眼癥模型的療效觀察

劉榮，劉長明，崔樂樂，周正，韋曉丹

（河北省唐山工人醫院眼科，河北 唐山 063000）

論著

玻璃酸鈉和Omega-3必需脂肪酸混合滴眼液對去勢雄兔干眼癥模型的療效觀察

劉榮，劉長明，崔樂樂，周正，韋曉丹

（河北省唐山工人醫院眼科，河北 唐山 063000）

目的探討玻璃酸鈉和Omega-3必需脂肪酸（Omega-3 EFAs）混合滴眼液對去勢雄兔干眼癥治療的有效性。方法將15只新西蘭成年雄兔隨機分為正常對照組（A）、非治療組（B）、玻璃酸鈉治療組（C）、Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs聯合治療組（E），每組3只。對B、C、D、E組行去勢術復制動物模型，造模成功后C、D、E組雄兔雙眼分別以玻璃酸鈉滴眼液、Omega-3 EFAs滴眼液、玻璃酸鈉及Omega-3 EFAs混合滴眼液治療，每日10次，連續1個月。全部實驗兔行Schirmer 1試驗，測定淚膜破裂時間，行角膜熒光素染色評分，Western blot檢測兔淚腺組織中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達。結果各組指標經LSD-t檢驗顯示，藥物干預后玻璃酸和Omega-3 EFAs混合滴眼液組淚液分泌量、淚膜穩定性高于其他實驗組，差異有統計學意義（P＜0.05）；淚腺組織內TNF-α的表達低于其他實驗組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論局部應用玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液治療去勢雄兔干眼癥可明顯改善雄兔眼表體征，降低淚腺組織TNF-α的表達。

干眼癥；玻璃酸鈉；Omega-3必需脂肪酸；腫瘤壞死因子-α

干眼癥（dry eye，DE）是一種常見的具有潛在危害的眼表疾病，包括多種眼表癥狀如眼表干燥、發紅、燒灼感、視力波動，以及眼表病理學改變如角膜上皮的缺損和淚腺細胞的鱗狀化生。研究顯示[1-2]，造成DE的重要機制是淚膜功能障礙導致的炎癥[3]。Omega-3必需脂肪酸（Omega-3 essential fatty acids，Omega-3 EFAs）是具有多種生物學功能的必需脂肪酸，研究證實其具有調節抗氧化酶的活性，阻斷炎癥因子的基因編碼的作用[4-5]，包括白介素-1α、白介素-6、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等[6]。玻璃酸鈉滴眼液是臨床治療干眼癥的常用藥物，但是單獨使用并不能完全解決干眼癥癥狀。本實驗用去勢雄兔復制干眼癥模型，探討玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液治療干眼癥的療效及對眼表炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥物

健康1月齡新西蘭雄兔15只，體重（0.5±0.2）kg，由天津醫科大學動物中心提供。玻璃酸鈉滴眼液（德國URSAPHARTM Arzne），Omega-3 EFAs（美國Sigma Aldrich公司），淚液分泌測定濾紙、熒光素鈉染色劑（天津晶明新技術開發有限公司），山羊抗兔TNF-α抗體、β-actin、人抗山羊IgG（Santa Cruz），PIPA蛋白裂解液、Trizol試劑（碧云天生物技術研究所），抗體稀釋液、蛋白封閉液（北京博奧森公司），SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（北京普利來基因技術有限公司），PVDF膜（北京索萊寶科技有限公司），蛋白質Marker（Fermentas公司），甲醇、濃鹽酸等其他化學試劑均為國產。

1.2 動物模型復制

將實驗兔固定于兔架上，氯胺酮（0.05ml）50mg/kg肌內注射全身麻醉，陰囊局部加用鹽酸利多卡因局部麻醉，將一側睪丸由腹腔擠入陰囊，用刀片作一陰囊切口，用力擠出睪丸，結扎精索靜脈及輸精管后，切除睪丸及附睪，另一側睪丸及附睪同法切除，術后預防感染。檢查均由同一人完成，每次檢查時間、地點、照明亮度、濕度及溫度相同，于實驗前和實驗后2、3、4周，2、3個月行SchirmerⅠ試驗、BUT檢測及角膜熒光素染色。1.3實驗分組及給藥方法

0.2%Omega-3 EFAs溶液配制：0.2%Omega-3 EFAs溶于三蒸水中；玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合液配制：0.2%Omega-3 EFAs溶于玻璃酸鈉滴眼液中。將15只新西蘭成年雄兔隨機分為正常對照組（A）、非治療組（B）、玻璃酸鈉治療組（C）、0.2% Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E），每組3只。對B、C、D、E組行去勢術復制動物模型，術后3個月動物模型成功復制后，C、D、E組雄兔雙眼分別以玻璃酸鈉滴眼液、0.2%Omega-3 EFAs滴眼液、玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合滴眼液治療（混合后滴眼），每日自9～18點每小時滴雙眼1次，每次30μl，每日10次，連續1個月。

1.4 檢查方法

①SchirmerⅠ試驗：用5 mm×35 mm淚液檢測濾紙條，一端彎折5 mm，置于下瞼外側1/3淚腺囊內，余部分懸垂于皮膚表面。5 min后測量濾紙濕潤長度。②淚膜破裂時間（BUT）：熒光素鈉濾紙生理鹽水浸潤后涂抹于模型兔下瞼淚腺囊內，眼瞼閉合數次使熒光素均勻分布于角膜表面，于鈷藍光下觀察，從最后一次瞬目開始計時，記錄淚膜上出現第一個破裂點的時間。③角膜熒光素染色評分（FL）：熒光素染色后鈷藍光下觀察，采用0～12分制方法記錄染色結果，將角膜分為4個象限，0分：無染色（-）；1分：1～30個點狀著色；2分：＞30個點狀著色但染色未融合；3分：角膜點狀著色融合、絲狀物及潰瘍等。

1.5 Western blot檢測TNF-α的表達

1.5.1 組織總蛋白提取每組雄兔以空氣栓塞法處死后立即取適量淚腺組織（1～2 ml），反復用單去污劑裂解液（PMSF）400μl裂解制成組織勻漿（于冰上），將組織勻漿移至1.5 ml離心管中離心（12 000 r/min×5 min，4℃），取上清液置于-20℃冰箱冷凍保存。

1.5.2 Western blot步驟配制分離膠及濃縮膠，灌膠上樣，調整各組蛋白的含量約50μg，加入200μl EP管中，每管7μl的蛋白上樣緩沖液，調整體積為45μl，電泳（先恒壓80 V，待溴酚藍跑至分離膠后改為橫流35 mA，距離底部0.5 cm時，停止電泳），轉膜：PVDF膜浸泡于甲醇中60 min激活，轉膜條件橫流200 mA，60 min。取出PVDF膜放入TBST中漂洗（3×10 min），將膜浸入封閉液中，置于搖床上室溫封閉60 min。一抗孵育4℃過夜約12 h，室溫下繼續孵育2 h。TBST清洗3×7 min。二抗孵育：將膜放入稀釋好的二抗（1∶1 000）中置于搖床上室溫孵育3 h。TBST清洗3×7 min。按比例（1∶1）配好顯色液，將膜平鋪于玻璃板上，吸取適量顯色液滴加于膜上，反應約1 min后，放入凝膠成像分析儀器中，曝光照相保存。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模成功

去勢模型兔術后3周，淚液分泌開始減少,淚膜穩定性下降，3個月后，模型雄兔體重較對照組無明顯變化，角膜干燥，角膜表面染色，淚液分泌及淚膜穩定性降低，并呈時間依賴性，與對照組相比差異有統計學意義。去勢后3個月雄兔作為去勢干眼癥模型用于實驗。

2.2 實驗檢測

2.2.1 SchirmerⅠ治療后，玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）與玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）以及非治療組（B）比較，經LSD-t檢驗，差異有統計學意義（t= 14.225、10.060和14.361，P=0.000）；玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合治療組（E）與正常對照組（A）比較，差異無統計學意義（t=0.624，P=0.567）。見附表。

附表各組治療前后眼表實驗檢測結果及淚腺組織內TNF-α表達比較（n=3±s）

附表各組治療前后眼表實驗檢測結果及淚腺組織內TNF-α表達比較（n=3±s）

注：1）與非治療組（B）比較，P＜0.05；2）與玻璃酸鈉治療組（C）比較，P＜0.05；3）與Omega-3 EFAs治療組（D）比較，P＜0.05；4）與同組治療前比較，P＜0.05；5）與玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合治療組（E）比較，P＜0.05；6）與正常對照組（A）比較，P＜0.05

SchirmerⅠBUTFLTNF-α治療前治療前治療前治療后A組18.067±0.51317.467±1.1501）2）3）15.000±1.00015.000±1.7321）2）3）4）001）2）3）5）0.195±0.0101）2）B組3.700±0.7813.334±1.3052）3）5）6）5.000±1.0002.000±1.0002）3）4）5）6）7.333±1.5289.000±1.0002）3）5）6）0.461±0.0382）3）5）6）C組4.800±0.65615.367±0.6661）3）4）5）6）4.333±0.57711.667±2.5171）4）6）6.334±1.5281.667±0.5771）3）4）6）0.338±0.0191）3）5）6）D組4.633±0.55113.300±1.1141）2）4）5）6）4.333±0.88210.000±1.0001）4）5）6）6.667±0.5773.667±0.5771）2）4）5）6）0.212±0.0151）2）E組4.300±0.80018.067±1.2061）2）3）4）4.667±0.57713.334±1.5281）3）4）6.000±1.0001.333±0.5771）3）4）0.180±0.01131）2）F值252.0887.2794.841.94__3.64 P值0.0000.0000.0000.000__0.0442治療后治療后治療后

2.2.2 BUT經LSD-t檢驗，玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）經藥物治療后淚膜穩定性均有提高，差異有統計學意義（t=19.579、16.232和22.182，P=0.000）；玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）與非治療組（B）比較淚膜穩定性差異有統計學意義（t=6.182、5.173和10.750，P=0.004、0.013和0.000），玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）與正常對照組（A）、玻璃酸鈉治療組（C）比較淚膜穩定性差異無統計學意義（t=1.249和0.981，P=0.280和0.382）。見附表。

2.2.3 FL經LSD-t檢驗，玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2% Omega-3 EFAs混合治療組（E）藥物治療后角膜染色較治療前減少（t=4.949、2.828和7.002，P=0.008、0.047和0.002）。見附表。

2.2.4 TNF-α表達相應藥物治療后，玻璃酸鈉治療組（C）、0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）、玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合治療組（E）與非治療組（B）TNF-α表達經LSD-t檢驗，差異有統計學意義（t=5.014、10.557和12.277，P=0.007、0.000和0.000），0.2%Omega-3 EFAs治療組（D）及玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合治療組（E）治療后TNF-α表達與正常對照組（A）相當（t=1.633和0.229，P=0.178和0.830），玻璃酸鈉和0.2%Omega-3 EFAs混合治療組（E）與玻璃酸鈉治療組（C）TNF-α表達比較，差異有統計學意義（t=12.379，P= 0.000）。見附表和附圖。

附圖檢測淚腺組織中TNF-α的表達

3 討論

炎癥是干眼癥發生、發展的重要因素，炎癥因子的產生不僅可刺激淋巴細胞增生對淚腺造成免疫攻擊，自身也會干擾淚腺的正常分泌。淚腺的腺泡細胞可以表現為一種抗原表達細胞，刺激淋巴細胞的增生，因此淚腺可能是最先具有免疫應答的組織，并產生異常調節[7]。研究顯示在干眼癥患者淚腺組織中TNF-α的表達增高，而給予外生性TNF-α，會抑制神經遞質的釋放，減弱淚腺的分泌，因此減少炎癥因子的表達是干眼癥治療的重點[8]。

Omega-3 EFAs是一種天然的調節劑，除了可以調節抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及抑制促氧化酶的產生外，還可以通過向類花生四烯酸的轉化代謝過程中調節炎癥性和免疫應答[7，9]。Omega-3 EFAs的代謝產物包括α亞麻酸及它的去飽和產物二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十六碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）[6]。EPA是抗炎因子的前體，可抑制IL-α、β和TNF-α的生成。DHA是具有神經保護作用的D1的前體，可以保護淚腺組織和眼表細胞免于由TNF-α介導的凋亡[10]。實驗證實[6，9]單獨使用Omega-3 EFAs可在細胞和分子水平減少炎癥因子如CD11b+、IL-1α和TNF-α的表達。本實驗結果證實單獨使用Omega-3 EFAs組及玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合組均減少淚腺組織內TNF-α的蛋白表達，兩組間TNF-α的表達差異無統計學意義，說明Omega-3 EFAs可能有抑制眼表炎癥的作用。

玻璃酸鈉滴眼液廣泛應用于干眼癥的臨床治療中，玻璃酸鈉具有非牛頓液體的特性和極好的生物相容性，其溶液具有高度的黏彈性，分子鏈越長，黏彈性越好，黏度隨切變的增大而明顯減小，即使藥液的黏度很高，眼瞼仍然可眨眼自如沒有黏糊感。同時玻璃酸鈉除潤滑眼表面，改善眼表刺激癥狀外還可改善干眼癥患者角膜表面規律從而改善其視功能并減輕畏光現象[11-12]，但單獨使用玻璃酸鈉滴眼液并不能完全解決干眼癥患者的所有癥狀。本實驗證實，單獨使用玻璃酸鈉治療可有效地改善淚膜質量，減少角膜染色并可局部控制炎癥，玻璃酸鈉治療組及玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合組在BUT和FL檢測中差異無統計學意義。應用玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液后有效改善干眼癥雄兔臨床癥狀并減少炎癥因子的表達，角膜熒光素染色評分、淚腺組織內TNF-α均明顯低于其他實驗組，通過Western blot檢測證實玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合制劑可明顯降低炎癥因子TNF-α的表達。

綜上所述，玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液可改善干眼癥雄兔的角膜失代償，減少炎癥因子的產生。綜合玻璃酸鈉對角膜的保護作用和Omega-3 EFAs的抗炎作用，玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液以協同的方式改善干眼癥的癥狀和體征。實驗證實，使用玻璃酸鈉和Omega-3 EFAs混合滴眼液的臨床治療效果更好。

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（申海菊編輯）

Effects of mixed eye drops of omega-3 essential fatty acids and sodium hyaluronate on ocular surface of dry eye model of castrated male rabbits

Rong Liu,Chang-ming Liu,Le-le Cui,Zheng Zhou,Xiao-dan Wei
(Department of Ophtalmology,Tangshan Gongren Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China)

Objective To investigate the efficacy of the topical application of omega-3 essential fatty acids (EFAs)and sodium hyaluronate mixture in a rabbit model of experimental dry eye(EDE).Methods Fifteen healthy New Zealand rabbits were randomly divided into 5 groups with 3 rabbits in each group,i.e.normal group(A),non-treatment group(B),sodium hyaluronate therapy group(C),omega-3 EFAs therapy group(D), and mixed sodium hyaluronate and omega-3 EFAs therapy group(E).The rabbits in the groups B,C,D and E had bilateral testis and epididym resected.After successful building of xerophthalmia model,the groups C, D and E were treated with sodium hyaluronate,omega 3 EFAs and combined sodium hyaluronate and omega 3 EFAs in two eyes,10 times a day for a month.All the experimental rabbits received SchirmerⅠtest,the breakup time of tear film and corneal fluorescein staining scores were determined.Tumor necrosis factor α (TNF-α)in lacrimal tissue was detected by Western blot.Results LSD-ttest showed the rabbits in the group E showed a significant improvement in lacrimal secretion and tear film stability compared with other groups, the differences were statistically significant(P＜0.05).A significant decrease in the TNF-α level was observed in the group E,the differences were statistically significant from other groups(P＜0.05).Conclusions Topical application of mixed eye drops containing sodium hyaluronate and omega 3 EFAs could improve the ocularsurface signs and decrease the expression of TNF-α in lacrimal gland of xerophthalmia model of castrated male rabbits.

dry eye;sodium hyaluronate;omega-3 essential fatty acids;TNF-α

R777.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.004

1005-8982（2016）23-0016-05

2016-03-17