EBERs對鼻咽癌轉移的作用及其機制研究

程世越，李智，盧建紅，左埒蓮

（1.中南大學湘雅醫院分子醫學研究中心，湖南 長沙 410008；2.中南大學腫瘤研究所，湖南 長沙 410078）

論著

EBERs對鼻咽癌轉移的作用及其機制研究

程世越1，李智1，盧建紅2，左埒蓮2

（1.中南大學湘雅醫院分子醫學研究中心，湖南 長沙 410008；2.中南大學腫瘤研究所，湖南 長沙 410078）

目的探討EBERs對鼻咽癌轉移的作用及其機制。方法在鼻咽癌細胞中轉染EBERs，熒光定量PCR（RT-PCR）檢測細胞中轉移相關指標（如MMP）的相對表達量，同時Transwell檢測EBERs對鼻咽癌細胞遷移能力的影響。構建敲除EBERs的BAC-EBV（p2089）質粒，轉染鼻咽癌細胞，檢測細胞的轉移能力。轉染EBERs后Western blot檢測上皮間質轉化（EMT）相關指標，免疫熒光檢測ZO-1的表達。結果鼻咽癌細胞轉染EBERs質?；騪2089質粒后，RT-PCR檢測發現轉移相關指標表達升高，Transwell檢測結果顯示細胞遷移能力增強，而在干擾EBERs或轉染敲除EBERs的p2089質粒后，轉移能力減弱。轉染EBERs后E-cadherin表達降低，Vimentin升高，同時免疫熒光檢測發現ZO-1表達降低。結論EBERs可能通過促進EMT高表達而促進鼻咽癌的轉移。

EBERs；鼻咽癌；轉移；上皮間質轉化

EBV屬于人嗜淋巴γ皰疹病毒，在人群中的感染率高達95%，與鼻咽癌（NPC）、胃癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等多種腫瘤有較強的相關性。EBV能夠合成2種非編碼RNA（EBERs）即EBER1和EBER2，分別由167和172個核苷酸組成，它們是在EBV感染多種細胞（淋巴細胞、鼻咽或胃上皮細胞）后的3個潛伏期中表達量最高的轉錄本，豐度高達107/細胞[1]，臨床上可以作為檢測EBV感染的指標[2]。EBERs在EBV感染的細胞中普遍存在，但其在體內的生物學功能卻較為復雜，已有報道證實，EBERs能夠促進淋巴瘤的發生、發展，但其在其他包括鼻咽癌在內的相關腫瘤中的功能仍不明確。鼻咽癌是一種具有高發病率和致死率的頭頸部腫瘤，在流行地區被證實均有EBV的感染。有研究證實，鼻咽癌的發生與EBERs有一定相關性[3]，但并未明確二者之間的因果關系。本研究旨在探討EBERs是否能夠促進鼻咽癌細胞的轉移及其作用機制，為鼻咽癌臨床治療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系

鼻咽癌細胞系CNE1、HNE1、6-10B、C666-1培養于含10%胎牛血清的RPMI（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），并加入100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素。

1.2 質粒構建

pcDNA3.1-EBERs 10拷貝質粒由本實驗室構建和保存，BAC質粒、含EBV B95-8株全基因組的BAC質粒（BAC-EBV）p2089由德國GSF國家環境與衛生研究中心的Hammerschmidt教授惠贈，p2089敲除EBERs質粒的構建流程如下[4-5]。

1.2.1 引物設計EBER1同源重組正向引物：CCC AAGCTTGACGTAGTCTGTCTTGAGGAAGGCTGGAG CTGCTTCGAA，反向引物：CGGAATTCATCCTAAAA CAAAAGTTTGGTCTAGAGTCGACCTGCAGTTCG；E BER2同源重組正向引物：CCCAAGCTTTAGAGTTA CGGTTCGCTACAAGGCTGGAGCTGCTTCGAA，反向引物：CGGAATTCGTGGGTGCAAAACTAGCCACTCT AGAGTCGACCTGCAGTTCG。

1.2.2 電轉化感受態細菌的準備首先將表達重組蛋白redαβγ的溫敏質粒pKD46按化學方法轉化至含p2089質粒的大腸桿菌中，得到p2089-pKD 46細菌，30℃培養，具有氯霉素（Cam）和氨芐青霉素（Amp）抗性，將該細菌制備電轉化感受態細胞。

1.2.3 EBERs重組片段的線性轉化將純化的EBERs重組PCR片段100 ng電轉化至BAC-pKD46感受態細胞中，30℃、180 r/min培養2 h，離心后將菌液涂板與含卡那霉素（Kan）的LB培養板上，30℃培養過夜后37℃繼續培養24 h，將具有Kan抗性的菌落在含有Kan和Cam的LB培基中42℃培養24 h以消除pKD46質粒。

1.2.4 切除重組體中的Kanr基因將重組后線性轉化的細菌制成感受態細胞，將表達重組蛋白FLP的溫敏質粒pCP20轉化至感受態中，在含有Amp的LB培養板上30℃培養48h，挑取菌落至含Cam的LB培基中，42℃培養以消除pCP20，將只有Cam無Kan和Amp的菌液在含有Cam的LB培養板上培養以純化細菌。

1.3 Transwell遷移實驗

實驗使用8 μm孔徑的24孔板Transwell小室（Coring，NY，USA）。提前將Transwell小室預冷，在上室中加入100μl稀釋的Matrigel（用RPMI 1640稀釋10倍，BD Biosciences，San Diego，CA），4℃靜置10min后將Matrigel吸走，37℃放置1h。細胞消化計數后將3×104個細胞重懸于200 μl無血清培基中并加入上室，下室加入700 μl完全培養基。37℃培養48h后取出小室，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色后進行細胞計數。

1.4 熒光定量PCR

鼻咽癌細胞按照Trizol法提取RNA，使用Prime Scrip RT reagent kit with gDNA Eraser（TaKaRa& Clontech，Japan）進行逆轉錄，熒光定量PCR根據CFX-96 PCR系統（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）要求配制反應體系（見附表）。

附表引物及siRNA序列

續附表

1.5 Western blot

細胞加入適量蛋白裂解液RIPA，冰上裂解30 min，4℃離心10 629 r/min離心15 min，BCA法測蛋白濃度按照Thermo Pierce公司的說明書進行操作。將蛋白變性，上樣進行SDS-PAGE電泳分離，再將蛋白電轉至PVDF膜上，5%牛奶室溫封閉1 h，將一抗E-cadherin、Vimentin、Tubulin（Cell Signaling Technologies，Danvers，MA，USA）4℃孵育過夜，第2天二抗室溫孵育1 h，用Pierce公司的發光液對膜上蛋白顯影，Biorad成像儀成像分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism 5.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間數據比較用t檢驗，t檢驗為雙側檢驗，Transwell的相對細胞數用Image J 4.2進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌細胞轉染EBERs后轉移能力增加

EBERs表達質粒轉染EBV陰性的鼻咽癌細胞CNE1-con、6-10B-con和HNE1-con 48 h后，Transwell檢測細胞的侵襲能力發現，EBERs能夠增強鼻咽癌細胞的侵襲能力（見圖1A）。同時通過比較細胞生長曲線發現，EBERs對鼻咽癌細胞的增殖能力無明顯影響（見圖1B）。

2.2 敲除EBERs的p2089質粒構建

設計并利用EBER1和EBER2敲除引物從pKD13質粒上PCR擴增兩側帶有FRP重組位點的Kanr基因，瓊脂糖凝膠電泳證實攜帶有EBER兩側同源臂的Kanr基因擴增成功（見圖2A）。該片段電轉化至攜帶有EBV質粒p2089和同源重組酶表達質粒pKD46的大腸桿菌BAC-46，Kan篩選后經PCR檢測證實EBER被成功敲除（見圖2B）。進一步轉化pCP20質粒去除Kanr基因，Kanr基因引物進行PCR鑒定，證實Kanr基因已經從重組質粒上切除（見圖2C）。

2.3 EBERs促進鼻咽癌細胞轉移相關基因的表達

鼻咽癌細胞轉染EBERs 48 h后PCR檢測發現EBERs可以促進ITGB3在CNE1和HNE1中的表達，MMP2在CNE1和HNE2中的表達，以及MMP13在CNE1、HNE1和HNE2中的表達（見圖3A）。在EBV陽性的鼻咽癌細胞C666-1中用siRNA干擾EBER1和EBER2（siRNA序列見附表），PCR檢測結果可以看出ITGB3、MMP2、MMP13降低（見圖3B），從而反向驗證EBERs具有促進鼻咽癌轉移的作用。

圖1 EBV陰性鼻咽癌細胞瞬轉EBERs后細胞的遷移和增殖能力

圖2 從p2089質粒成功切除EBERs基因

在EBV陰性的鼻咽癌細胞CNE2中轉染p2089及敲除EBERs的p2089質粒，48 h后PCR檢測轉移相關基因的表達，可以觀察到MMP2、MMP3、MMP9在轉染p2089后升高，而敲除EBERs后則抑制p2089質粒對MMP2、MMP3、MMP9基因表達的上調（見圖3C）。

2.4 EBERs促進鼻咽癌細胞的上皮間質轉化

EBV陰性的6-10B細胞中轉染EBERs后，細胞形態由短小的橢圓形變成周圍有細長角的不規則形，且細胞之間的黏附變得松散（見圖4A），這種形態改變被認為是上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的典型過程。Western blot驗證EMT相關分子的變化（見圖4B），發現EBERs的表達使得E-cadherin降低，Vimentin升高，同時免疫熒光檢測結果顯示ZO-1的表達低于對照組（見圖4C）。

圖3 EBERs促進鼻咽癌細胞轉移相關基因的表達（±s）

圖4 EBERs促進鼻咽癌細胞6-10B的EMT表型和相關基因表達

3 討論

鼻咽癌在我國南方高發，EBV是鼻咽癌的致病因素之一。EBERs是EBV編碼的非翻譯RNA在EBV潛伏感染階段豐度最高的轉錄本，具有獨特的二級莖環結構。自1981年首次發現EBERs以來，EBERs的研究重點主要在其二級結構、結合蛋白，以及對細胞的轉化功能，潛伏致癌性[6]，但EBERs的具體功能仍不明確。EBERs在EBV致病的傳染性單核細胞增多癥以及一些EBV相關的腫瘤如鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤中表達[7]，早在90年代日本研究團隊已經證實，EBV可以促進Burkitt淋巴瘤細胞Akata的發生、發展以及增加抗凋亡能力，其后他們又進一步證實，EBERs對Akata細胞的這些改變也同樣產生作用[8]，在EBV陰性的Akata細胞中過表達EBERs，細胞軟瓊脂克隆形成能力、抗凋亡能力增強，癌基因Bcl-2升高，并且認為EBERs的這些功能可能與PKR相關。此后，EBERs對腫瘤的相關功能研究也逐漸增多，但主要是針對淋巴瘤進行探討，對鼻咽癌、胃癌的研究較少。

EBERs與鼻咽癌的相關性研究較少且不深入，早期有研究表明EBERs可以作為鼻咽癌轉移的一個分子指標[9]，而較近的研究通過鼻咽癌臨床樣本實驗分析[10]，提示EBERs的高表達可能作為鼻咽癌預后較好的一個指標，與之前的結論相互矛盾。因此，EBERs在鼻咽癌中發揮何種功能至今沒有明確結論。本研究從細胞層面探討EBERs是否能夠促進鼻咽癌細胞的轉移。筆者在鼻咽癌細胞中瞬時轉染EBERs，觀察到鼻咽癌的侵襲轉移能力增強，但是對其增殖沒有明顯影響，PCR檢測表明轉移相關基因MMP2、MMP3等均顯著上升，同時在C666-1細胞中通過干擾EBERs反向驗證以上結論。為了進一步驗證EBV基因組中的EBERs對鼻咽癌的作用，筆者引入EBERs敲除的p2089質粒，瞬時轉染鼻咽癌細胞，同樣證實EBERs能夠促進鼻咽癌細胞的轉移能力及轉移相關基因的表達。

發生轉移的腫瘤細胞需脫離相鄰的細胞而進入周圍環境中，這需要腫瘤細胞失去細胞-細胞間黏附并獲得極性，其中EMT在腫瘤轉移中起著重要作用。發生EMT時上皮細胞向可游離的間質細胞轉化，細胞形態由鵝卵石樣向梭形轉變，細胞分子發生改變。腫瘤細胞發生轉移可由EMT介導的結論在過去的研究中已經很明確，例如RU等[11]研究的miRNA-29b可以通過抑制EMT從而抑制前列腺癌的轉移；EMT在鱗狀細胞癌的轉移中起著重要的作用[12]。通過實驗證實鼻咽癌細胞系6-10B瞬轉EBERs后形態發生改變，與EMT的經典表型一致，通過Western blot及免疫熒光進一步驗證EBERs能夠促進EMT相關分子的表達。

綜上所述，EBERs能夠促進鼻咽癌的侵襲轉移，并且該過程可能是通過EMT介導，本結果將為鼻咽癌抗復發和轉移的臨床治療提供新的潛在靶點。

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（申海菊 編輯）

EBERs promote metastasis of nasopharyngeal carcinoma via epithelial-mesenchymal transition

Shi-yue Cheng1,Zhi Li1,Jian-hong Lu2,Lie-lian Zuo2
(1.Center for Molecular Medicine,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha, Hunan 410008,China;2.Cancer Research Institute,Central South University, Changsha,Hunan 410078,China)

Objective To investigate whether EBV encoded RNAs(EBERs)could promote metastasis of nasopharyngeal carcinoma(NPC)and the possible involvement of epithelial-mesenchymal transition(EMT)in this process.Methods EBERs expression plasmid was transfected into EBV negative NPC cell lines with lipofectamine 2000.48 h after transfection,matrigel migration assay and cell counting were conducted to explore the impact of EBERs on NPC migration and proliferation,respectively.In addition,siRNA targeting EBERs was applied to EBV positive C666-1 cells,after that the expression changes of metastasis related genes were detected.To consolidate the observation,EBERs-deleted EBV expression plasmid was contructed based on bacterial artificial chromosome(BAC)system.Then expression changes of metastasis related genes were compared between the cells harboring EBV with or without EBERs.Futhermore,the involvement of EMT associated genes in EBERs-mediated metastasis was explored via Western blot,and immunofluorescence was used to detect ZO-1 expression.Results Transient transfetion of EBERs significantly improved metastasis of NPC cells and expression of metastasis related genes.However,EBERs had no impact on NPC cell proliferation.In support of the observation,siRNA targeting EBERs or EBERs deletion significantly decreased expression of metastasis related genes.Furthermore,EBERs expression decreased ZO-1 and E-cadherin expressions while increased Vimentin expression.Conclusions EBERs could promote metastasis of NPC cells,and EMT probably contributes to this process.

EBERs;nasopharyngeal carcinoma;metastasis;EMT

R739.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.005

1005-8982（2016）23-0021-06

2016-08-30

李智，E-mail：peries@163.com；Tel：15802654231