抗原致敏IL-27基因修飾的樹突狀細胞活化的CTL對食管癌細胞線粒體膜電位及凋亡的影響

王少青，張晚魚，王大鵬,王世東,米 源,王 雷*

(1.河北省隆堯縣醫院胸外科，河北 隆堯 055350；2.河北省涉縣醫院病理科，河北 涉縣 056400;3.冀中能源峰峰集團有限公司總醫院外科，河北 邯鄲 056201；4.冀中能源峰峰集團有限公司總醫院皮膚性病科,河北 邯鄲 056201；5.河北醫科大學第四醫院胸外科，河北 石家莊 050011)

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·論 著·

抗原致敏IL-27基因修飾的樹突狀細胞活化的CTL對食管癌細胞線粒體膜電位及凋亡的影響

王少青1，張晚魚2，王大鵬3,王世東4,米 源5,王 雷5*

(1.河北省隆堯縣醫院胸外科，河北 隆堯 055350；2.河北省涉縣醫院病理科，河北 涉縣 056400;3.冀中能源峰峰集團有限公司總醫院外科，河北 邯鄲 056201；4.冀中能源峰峰集團有限公司總醫院皮膚性病科,河北 邯鄲 056201；5.河北醫科大學第四醫院胸外科，河北 石家莊 050011)

目的研究IL-27基因轉染的樹突狀細胞(dendritic cell，DC)活化CTL體內誘導食管癌細胞凋亡的影響。方法通過在裸鼠的移植瘤周注射食管癌細胞抗原致敏、IL-27基因修飾DC(DCIL-27+Ag)活化的特異CTL，采用流式細胞術檢測細胞凋亡水平，熒光染料羅丹明123染色檢測細胞線粒體膜電位水平并檢測caspase-3蛋白表達水平。結果5組之間凋亡率、膜電位水平、caspase-3表達差異均有統計學意義(P<0.05)：DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive、Tnaive組凋亡率、caspase-3表達均高于PBS組，膜電位水平低于PBS組；DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive組凋亡率、caspase-3表達均高于Tnaive組，膜電位水平低于Tnaive組；DCIL-27+Ag、DCIL-27組凋亡率、caspase-3表達均高于DCnaive組，膜電位水平低于DCnaive組；DCIL-27+Ag組凋亡率、caspase-3表達均高于DCIL-27組，膜電位水平低于DCIL-27組。結論在荷瘤小鼠體內，經食管癌細胞抗原致敏、IL-27基因修飾的DC可活化特異性CTL產生較強的細胞毒作用，其機制可能是CTL通過降低食管癌細胞線粒體膜電位，啟動內源性線粒體凋亡途徑，激活caspase-3蛋白，從而誘導細胞凋亡。

食管腫瘤；樹突狀細胞；白細胞介素27；細胞凋亡

食管癌是最常見的上消化道惡性腫瘤之一，每年其發病率在全球范圍居惡性腫瘤第8位，約有45.6萬新發病例；病死率在全球范圍居惡性腫瘤第6位，每年近40 萬死亡病例，其中我國食管癌的發病率和病死率約占世界的 50%[1-3]。中晚期食管癌患者即使經過手術和放化療等傳統治療，仍易于復發轉移，其中免疫缺陷被認為是食管癌復發和轉移的關鍵因素之一。最近的資料顯示過繼免疫治療可以改善晚期腫瘤患者的免疫抑制狀態，是一種具有較高安全性和有效的治療方法[4-6]。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是體內最有效的抗原提呈細胞，在誘導機體免疫應答及特異性抗腫瘤免疫中發揮重要作用。荷瘤宿主體內的DC異常是導致腫瘤細胞免疫逃逸的重要方面，這使其不能有效提呈腫瘤抗原和提供協同刺激信號，從而不能細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)進行有效激活而導致腫瘤發生發展。目前，以DC 為基礎的腫瘤免疫治療及DC 疫苗等方面已取得較大進展[7-8]。白細胞介素27(interleukin 27，IL-27)是IL-6/IL-12家族細胞因子,主要來源于活化的單核巨噬細胞和DC。IL-27具有促進CTL產生和活化，增強CTL細胞對腫瘤細胞的殺傷能力。此外，IL-27可以抑制腫瘤新生血管生成而起到抗腫瘤作用[9-11]。本研究探討IL-27基因修飾的DC誘導食管癌細胞凋亡的機制，旨在為食管癌的生物治療提供一個新思路。

1 材料與方法

1.1細胞株與動物 PA317/IL-27由河北醫科大學第四醫院科研處提供。Eca109食管癌鱗癌細胞株由河北醫科大學第四醫院科研中心保存。 BALB/C(nu/nu)裸小鼠購自南京斯科瑞生物科技有限公司(合格證號：0158144)，3～4周齡，體質量16～18 g，雌雄各半，于無特定病原體環境喂養。

1.2試劑和儀器 淋巴細胞無血清培養基(GT-T551)購自上海聯遜生物科技有限公司；RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gemini公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶公司；Polybrene購自美國Sigma公司；羅丹尼123(Rhodanmine123，Rho123)購自中國Solarbio公司；碘化丙啶(PI)購自美國Sigma 公司；rhGM-CSF、 rhIL-4、rhIL-2購自美國Peprotech公司；PBS購自日本TAKARA公司；鼠抗人caspase-3單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；無菌培養板購自美國Costar公司；流式細胞儀(Epic-XLⅡ型)購自美國Beckmen Coulter公司。

1.3制備人食管癌細胞裸鼠移植瘤模型 Eca109細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基(青、鏈霉素各100 U/mL)，37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養傳代，將呈對數生長期的Eca109細胞制成單細胞懸液，每只于裸鼠右側背部皮下接種1×107細胞，成瘤標準為皮下結節直徑超過0.5 cm，成瘤率100%。

1.4DC的轉染和致敏 用淋巴細胞分離液分離食管癌患者的外周血，1 000 r/min離心30 min；吸取單個核細胞層進行細胞培養，單個核細胞貼壁2 h后吸取的懸浮細胞即是淋巴細胞，應用尼龍毛柱分離純化的自體T淋巴細胞(效應細胞)用于混合淋巴細胞反應研究。將單個核細胞培養的貼壁細胞隔天加rhIL-4(50 μg/L)，rhGM-CSF(100 μg/L) 5%CO2，37 ℃培養，獲得的細胞為DC。第6天將DC分組：DCIL-27+Ag組，抗原致敏IL-27基因修飾DC；DCIL-27組，IL-27基因修飾DC；DCnaive組，未轉染DC組。分別加PA317/IL-27培養上清、polybrene于DCIL-27+Ag組和DCIL-27組，轉染4 h后收集DC繼續培養。其中DCIL-27+Ag組加入Eca109細胞凍融抗原懸液后致敏DC 72 h。

1.5人食管癌細胞裸鼠移植瘤模型的實驗分組、治療和觀察、組織取材 將移植瘤裸鼠模型按照雌雄各半每組8只的原則隨機分成5組。將DC、DCIL-27和DCIL-27+Ag細胞濃度調節為2×107/mL后按1∶1比例與Tnaive細胞均勻混合。第1組作為對照于瘤體周圍注射PBS；第2組于瘤體周圍注射Tnaive；第3組于瘤體周圍注射DC +Tnaivel；第4組于瘤體周圍注射DCIL-27+Tnaive；第5組瘤體周圍注射DCIL-27+Ag+Tnaive，每4 d注射1次，每組每次均注射0.2 mL，共注射 5次，于注射完畢后1周處死裸鼠，切取腫瘤。

1.6流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡、線粒體膜電位及caspase-3蛋白表達變化

1.6.1流式細胞術檢測移植瘤組織細胞凋亡率 網挫法將每組移植瘤樣本制備成單細胞懸液，取單細胞懸液100 μL(含1×106個細胞)加入碘化丙啶1mL，在4 ℃冰箱中染色30 min后應用流式細胞儀檢測凋亡。對細胞凋亡應用Expo 32 ADC軟件進行分析。

1.6.2流式細胞術檢測移植瘤組織細胞線粒體膜電位 網挫法將每組移植瘤樣本制備成單細胞懸液并調整細胞數為1×106/mL，用冷PBS洗滌細胞，加入Rho 123染料并調整Rho 123濃度為10 mg/L，在37 ℃避光30 min，PBS洗滌細胞，上機檢測每組樣品的線粒體膜電位水平，用平均熒光強度表示線粒體膜電位水平。

1.6.3流式細胞術檢測移植瘤組織的caspase-3蛋白表達 網挫法將每組移植瘤樣本制備成單細胞懸液，調整每組樣品的細胞數為1×106/mL，用PBS洗滌細胞，100 μL PBS液懸浮細胞后每組樣本分別加入鼠抗人caspase-3抗體100 μL，室溫避光靜置30 min，PBS洗滌細胞，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液室溫避光孵育30 min，PBS 10 mL常規離心后棄上清，加入PBS 1 mL懸浮細胞，再經300目尼龍網過濾，然后上機檢測caspase-3蛋白量。用平均熒光強度表示蛋白的表達量。每組實驗重復3次。

1.7統計學方法 應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

5組之間凋亡率、膜電位水平、caspase-3表達差異均有統計學意義(P<0.05)。DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive、Tnaive組凋亡率、caspase-3表達均高于PBS組，膜電位水平低于PBS組；DCIL-27+Ag、DCIL-27、DCnaive組凋亡率、caspase-3表達均高于Tnaive組，膜電位水平低于Tnaive組；DCIL-27+Ag、DCIL-27組凋亡率、caspase-3表達均高于DCnaive組，膜電位水平低于DCnaive組；DCIL-27+Ag組在凋亡率、caspase-3表達均高于DCIL-27組，膜電位水平低于DCIL-27組。見表1，圖1。

表1 不同組別CTL細胞對細胞凋亡和細胞線粒體膜電位水平的影響Table 1 Effect of different DCs induce CTL producing on the tumor cells apoptosis rate，mitochondrial transmembrane potential and caspase-3 protein protein

圖1 DC活化的CTL對裸鼠人食管癌移植瘤細胞凋亡的影響A.PBS組;B.Tnaive組;C.DCnaive組;D.DCIL-27組;E.DCIL-27+Ag組Figure 1 Effect of different DCs induce CTL producing on the tumor cells apoptosis

3 討 論

晚期食管癌患者不但承受巨大腫瘤負荷，而且接受放、化療等綜合治療，不可避免地具有明顯的不良反應，呈現出免疫抑制狀態，造成腫瘤細胞的免疫逃逸，導致患者預后差。過繼性細胞免疫治療可以通過注射免疫活性細胞激發機體免疫功能，增強機體微環境的抗腫瘤能力，逆轉患者的免疫抑制狀態，最終改善疾病緩解率和延長生存期[12]。DC與腫瘤的發生、發展及預后均有一定的關系，DC功能缺陷或DC數量減少導致腫瘤免疫逃逸，使腫瘤得以發生、發展，活化的DC能將腫瘤抗原提呈給T細胞，是抗腫瘤，免疫的啟動者。有研究表明DC能激活特異腫瘤相關T淋巴細胞抗腫瘤，并且能直接對腫瘤細胞有細胞毒作用[13]。

IL-27作為一種具有多種生物學活性的免疫調節因子可作用于免疫系統發揮廣泛的免疫調節作用[14]。IL-27可以通過促進細胞毒性T細胞的產生和活化來增強抗腫瘤免疫。Kachroo等[15]研究顯示，在非小細胞癌中IL-27通過STAT1抑制上皮-間質轉化和腫瘤血管生成的作用進而抑制腫瘤的發生發展。此外，IL-27可以體外抑制前列腺癌細胞增殖，體內抑瘤實驗可以顯著抑制腫瘤生長和微血管形成[16]。筆者在前期研究中發現食管癌組織及引流淋巴結中DC存在著功能缺失。IL-27 基因修飾可以增強DC在體外誘導產生特異性T淋巴細胞達到抗食管癌作用，其機制可能與IL-27可以活化 T 淋巴細胞，致使 CTL分泌IFN-γ 的能力增強有關[17-18]。本研究通過體內實驗進一步探討IL-27 基因修飾DC后誘導產生的CTL細胞抗腫瘤的機制。

細胞凋亡是由多種基因參與調控的細胞主動的程序性細胞死亡，主要包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑等三大途徑，其中線粒體途徑屬于內源性凋亡途徑，其特征是線粒體內跨膜電位降低和耗散可以導致細胞色素C等釋放以及活化caspase家族蛋白酶，發生一系列的caspases級聯放大反應[19]。 Caspase家族蛋白酶作為凋亡過程中的效應蛋白，其活化程度和表達情況與凋亡密切相關，caspase-3作為整個凋亡級聯反應的核心蛋白，可以通過裂解細胞內某些重要底物蛋白，在線粒體凋亡途徑的凋亡執行期中發揮關鍵性的樞紐作用。Caspase-3表達降低可導致細胞凋亡停止并引起腫瘤的發生和發展[20-21]。Liu等[22]研究發現活化的caspase-3可以通過Bax依賴的線粒體途徑誘導結腸癌細胞凋亡。本研究結果顯示，DCIL-27+Ag組的腫瘤組織內細胞線粒體膜電位出現顯著降低，caspase-3蛋白表達水平呈現顯著增加。分析其機制可能是DCIL-27+Ag激活的CTL在體內可以通過降低細胞的線粒體膜電位水平和激發caspase級聯反應進而活化caspase-3蛋白表達，起到促進腫瘤細胞凋亡的作用，在體內體現出較強的特異性細胞毒作用，

綜上所述，經食管癌細胞抗原致敏、IL-27基因修飾的DC可活化特異性CTL，其誘導凋亡的機制可能與腫瘤細胞膜電位水平和caspase-3有關，本研究為IL-27臨床上應用于食管腫瘤的生物治療提供了一個新思路。

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(本文編輯：劉斯靜)

Effects of specific CTL which are activated by DC modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate on esophageal carcinoma cell mitochondria membrane potential and cell apoptosis

WANG Shao-qing1, ZHANG Wan-yu2, WANG Da-peng3, WANG Shi-dong4, MI Yuan5, WANG Lei5*

(1.Department of Chest Surgery， the Hospital of Longyao County, Hebei Province Longyao 055350, China; 2.Department of Pathology, Shexian Hospital of Hebei Province, Shexian 056400, China; 3.Department of Surgery, General Hospital of Fengfeng to Jizhong Energy Group, Handan 056201, China; 4.Department of Dermatology, General Hospital of Fengfeng to Jizhong Energy Group,Hebei Province Handan 056201, China; 5.Department of Thoracic Surgery, Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011, China)

ObjectiveTo explore the effect of specific cytotoxic lymphocyte(CTL) which are activated by dendritic cell(DC) modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate on esophageal carcinoma cell apoptosis.MethodsAfter making the nude mice models with esophageal cancer cell successfully, the mice were immunized with specific CTL which are activated by IL-27 gene modified DC loaded with esophageal tumor lysate(DCIL-27+Ag). The cell apoptosis rate was analyzed by Annexin V/PI staining. The mitochondrial membrane potential was measured by Rhodamine 123 staining and the expression level of caspase-3 protein was detected by flow cytometry.ResultsThe ratio of apoptosis, membrane potential of mitochondria and expression of caspase-3 of 5 groups showed significant difference(P<0.05).The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup were higher than those in PBS group(control group). The membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup was higher than that in PBS group. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Ag, group, DCIL-27group and,DCnaivegroup were higher than those in Tnaive group, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group and DCnaivegroup was lower than that in Tnaive group. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group were higher than those in DCnaivegroup, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup, DCIL-27group was lower than that in DCnaivegroup. The ratio of apoptosis and caspase-3 protein expression in DCIL-27+Aggroup,were higher than those in DCIL-27group, but the membrane potential of mitochondria in DCIL-27+Aggroup was lower than that in DCIL-27group.ConclusionSpecific CTL, activated by DC modified with IL-27 gene and esophageal tumor lysate, efficiently play cytotoxic effect on tumor-bearing mice in vivo through reducing the mitochondrial membrane potential, initiating the intrinsic mitochondrial apoptotic pathways and increasing caspase-3 protein expression.

esophageal carcinoma; dendritic cells; interleukin 27; cell apoptosis

2016-04-01；

2016-10-25

河北省醫學科學研究重點課題(20110136)

王少青(1981-)，男，河北隆堯人，河北省隆堯縣醫院主治醫師，醫學學士，從事胸外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:yuankundu@163.com

R735.1

A

1007-3205(2016)12-1402-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.010