恩替卡韋分散片人體藥動學及生物等效性研究

馬 杰，董占軍，白萬軍，宋浩靜，吳 茵，支旭然

(河北省人民醫院藥學部，河北 石家莊 050051)

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·論 著·

恩替卡韋分散片人體藥動學及生物等效性研究

馬 杰，董占軍*，白萬軍，宋浩靜，吳 茵，支旭然

(河北省人民醫院藥學部，河北 石家莊 050051)

目的評價2種恩替卡韋制劑在健康人體的生物等效性。方法20例男性健康志愿受試者隨機分成2組，分別交叉單劑量口服試驗制劑(恩替卡韋分散片)或參比制劑(恩替卡韋片)0.5 mg，2周后交叉服藥，采用高效液相色譜-串聯質譜法測定血漿中藥物濃度,以DAS 3.2.7軟件計算藥動學參數，進行生物等效性評價。結果2種制劑的峰濃度(Cmax)分別為(4.41±1.02) μg/L和(4.36±0.89) μg/L；達峰時間(tmax)為(0.66±0.19) h和(0.70±0.29) h；半衰期(t1/2)為(46.11±32.32) h和(61.28±93.69) h；曲線下面積(area under curve，AUC)0～72 h為(13.31±2.63) μg·h-1·L-1和(13.10±2.20) μg·h-1·L-1。結論2種恩替卡韋制劑生物等效,相對生物利用度為(103.3±14.0)%。

恩替卡韋；生物利用度；色譜質譜法

恩替卡韋的化學名為2-氨基-9-[(1S,3R,4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環戊基]-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮一水合物，是一種強效選擇性鳥嘌呤核苷類似物?？诜者M入肝細胞后，通過磷酸化作用形成單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯，尤其恩替卡韋三磷酸酯在肝細胞內抑制乙型肝炎病毒聚合酶的活性的形成，具有顯著的病毒抑制作用。臨床用于病毒復制活躍、血清丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)持續升高或肝臟組織學顯示有活動性病變的慢性乙型肝炎的治療, 由于恩替卡韋高效抑制乙型肝炎病毒的復制，耐藥性很低,幾乎沒有不良反應，近年來臨床應用日趨廣泛[1-6]。以中美上海施貴寶制藥有限公司生產的恩替卡韋片作為參比制劑，評價大連中信藥業股份有限公司提供的恩替卡韋分散片在健康人體內的藥動學，旨在為臨床合理應用恩替卡韋分散片提供參考依據。

1 材料與方法

1.1儀器與試驗藥物 AB Sciex Triple QuadTM5500 HPLC-MS/MS系統(美國AB Sciex公司)；Analyst Instrument Control and Processing Software 1.6.1(美國AB Sciex公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海精科實業有限公司)；Universal 16R低溫高速離心機(德國Hettich公司)。甲醇(色譜純，Germany Merk)；甲酸(含量88%，Fisher Scientific)；高氯酸(分析純，天津市東方化工廠)。恩替卡韋對照品(純度93.7%，批號101248-201202，中國食品藥品檢定研究院)；地西泮對照品(內標純度99.9%，批號171225-201304，中國食品藥品檢定研究院)。試驗制劑：恩替卡韋分散片(每片0.5 mg，批號20150401，大連中信藥業股份有限公司研制)。參比制劑：恩替卡韋片(每片0.5 mg，批號1501661，中美上海施貴寶制藥有限公司生產)。

1.2實驗方法

1.2.1研究對象 20例男性健康志愿受試者，年齡19～25歲，平均(21.95±2.57)歲，體質量(65.7±6.65) kg，身高(173.15±4.52) cm，經一般體檢和心、肝、腎功能的檢查均為正常者，受試前3個月未參加任何藥物臨床試驗、1個月內至試驗期間不服任何其他藥物，受試期間禁忌煙酒。

所有健康志愿受試者均簽署知情同意書，本試驗獲得河北省人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2.2試驗方案 將20例健康男性志愿受試者隨機分成2組各10例，禁食12 h后，分別單劑量口服試驗制劑恩替卡韋分散片0.5 mg或參比制劑恩替卡韋片0.5 mg，分別于服藥前及服藥后7、14、21、30、45 min，1、1.5、2、3、5、8、12、24、36、48、72 h，自肘靜脈取血4.0 mL，并立即轉移至經肝素干燥處理的試管中,離心5 min(3 500 r /min )，將上層血漿移至凍存管(EP管)中，置(-80±3) ℃冰箱中保存待測。服藥4 h后統一進低脂標準餐。2周清除期后2組藥物互換交叉服用，用藥期間和用藥后，健康志愿受試者均未出現任何不良反應。

1.2.3溶液的制備 標準溶液(1.00 g/L)：精密稱取恩替卡韋適量，加甲醇并稀釋使成1.00 g/L，搖勻，置冰箱中冷藏備用；精密稱取地西泮適量，加甲醇溶解并稀釋使成216.00 mg/L，內標溶液，搖勻，置冰箱中冷藏備用。

1.2.4色譜及質譜條件 色譜柱：XTerra MS C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A相)，0.1%甲酸甲醇溶液(B相)，洗脫梯度為0.5 min(95%A相)→3 min(25%A相)→4 min(5%A相)→5 min(5%A相)→5.1 min(95%A相)；流速：0.3 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：5 μL。離子源：ESI；離子極性：正離子(Positive)；離子檢測方式：多離子反應；離子源溫度：650 ℃；離子源噴射電壓：5 500 V；氣簾氣壓力：35 psi；碰撞氣壓力：12 Pa；源內氣體1(Gas 1，N2)壓力：60 Pa；源內氣體2(Gas 2，N2)壓力：60 Pa；恩替卡韋離子對m/z278.1→ 152.0，DP：80 V，CE：23V；地西泮離子對m/z285.1→154.0，DP：130V，CE：25V。

1.2.5血漿樣品處理方法 精密量取400 μL健康志愿受試者血漿樣品，依次加入40 μL內標標準溶液(地西泮108.00 μg/L)，10%高氯酸溶液160 μL，渦旋2 min，離心5 min(12 000 r/min)，取上清液5 μL進樣分析。

1.2.6專屬性 按“1.2.5”項條件處理血漿樣品，測得空白血漿、 空白血漿外加恩替卡韋標準溶液和內標及健康志愿受試者口服0.5 mg恩替卡韋分散片后0.23 h 的血漿樣品的色譜圖。恩替卡韋、地西泮(內標)的保留時間分別約為2.89、 4.81 min，空白血漿色譜圖中在2.89、4.81 min處無雜質峰出現，因此內源性物質對該藥測定無干擾。

1.3血漿標準曲線的繪制 精密量取空白血漿360 μL，加入系列恩替卡韋標準溶液，配置成血漿中恩替卡韋濃度為0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/L的血漿樣品，按“1.2.5”項下樣品處理方法操作，經高效液相色譜-串聯質譜法測定，以恩替卡韋濃度C為橫坐標，恩替卡韋與內標地西泮的峰面積比值Y為縱坐標，按加權最小二乘法進行回歸，得恩替卡韋血漿樣品標準曲線為Y=0.381C+0.004 23(r=0.996 2)，線性范圍0.05～20.00 μg/L，最低定量濃度(lowest limit of quantification,LLOQ)為0.05 μg/L。

1.4基質效應與殘留考察 考察恩替卡韋0.1、1.0、15.0 μg/L 3 個濃度(含地西泮內標溶液108.00 μg/L)的基質樣品溶液峰面積比率和同濃度的標準品溶液峰面積比率的比值。結果表明歸一化的基質因子分別為94.92%、94.15%、104.43%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)分別為12.15%、11.04%、6.49%，RSD值均<15%，符合2015版《中國藥典》的規定要求[7]。

分別取最高濃度200.00 μg/L的恩替卡韋溶液40 μL、內標溶液(108.00 μg/L)40 μL進樣分析，最高濃度分析完成后，立即進空白樣品進行分析，連續測試5次，考察恩替卡韋檢測的殘留效應。結果殘留值小于定量下限的20%，表明無殘留影響。

1.5回收率與精密度考察 在空白人血漿中加入不同量的恩替卡韋配制成LLOQ、低、中、高(0.05、0.1、1.0、15.0 μg/L)4種不同濃度的標準血樣(含內標濃度為為108 μg/L)，按“1.2.5”項下方法處理后進樣分析，每個濃度6份，連續測定3 d，并與標準曲線同時進行，求得回收率及日內、日間精密度，見表1。

表1 精密度及回收率試驗結果Table 1 Results of precision and recovery test (n=6)

1.6穩定性考察 考察了恩替卡韋0.1、1.0、15.0 μg/L 3種濃度血漿樣品的冷凍穩定性、凍融穩定性、室溫放置穩定性、進樣器中室溫放置穩定性。結果3種濃度冷凍穩定性RSD分別為4.23%、1.42%、2.33%，凍融穩定性RSD分別為6.42%、2.58%、3.19%，室溫放置穩定性RSD分別為4.34%、3.13%、2.26%，進樣器中室溫放置穩定性RSD分別為2.78%、2.7%、6.36%。以上符合生物制品測定要求[7]，表明在各條件下穩定性良好。

1.7質量控制 分別配置恩替卡韋血漿濃度為0.10、1.0、15.0 μg/L的血漿樣品作為質控樣品，按“1.2.5”項下方法處理后，均勻分布于8個分析批的受試者血漿樣本中。每批質控樣品及受試者血漿樣本的血藥濃度數據用隨行標準曲線求得。根據該分析批中質控樣品測定結果的準確度評價該批受試者血漿樣本的測定結果是否可被接受。結果表明，本研究所有質控樣品的測定結果其RSD均在15%(低濃度在20%)范圍內。8批次低、中、高濃度質控樣本測定結果的準確度均符合要求，表明所有受試者血漿樣本測定結果可信。

1.8統計學方法 應用 SPSS 19.0統計軟件處理數據，計量資料比較采用獨立樣本的t檢驗。P>0.05為差異無統計學意義。

2 結 果

2.1藥-時曲線 20例健康男性受試者單次口服試驗制劑恩替卡韋分散片和參比制劑恩替卡韋片后，所得不同時間的平均血藥濃度-時間曲線，結果顯示，試驗制劑達峰時間和血藥峰濃度略短于和大于參比制劑，見圖1。

圖1 20例受試者單劑量口服試驗制劑和參比制劑后恩替卡韋的平均藥-時曲線Figure 1 Mean plasma concentration-time curves of entecavir in 20 volunteers after oral dose of test and reference preparations

2.22組藥代動力學參數比較 應用DAS3.2.7軟件對每位健康志愿受試者的血藥濃度-時間數據進行擬合，計算主要藥代動力學參數，即血藥峰濃度(maximum concentranion,Cmax)、達峰時間(Tmax)、半衰期(t1/2)、 0～72 h藥-時下曲線面積(AUC0～72 h)、藥物從零時間至所有原形藥物全部消除時間的藥-時曲線下總面積(AUC0～∞)。結果顯示試驗制劑組與參比制劑組在Cmax、Tmax、t1/2、AUC0～72 h、AUC0-∞差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 20例受試者單劑量口服試驗制劑與參比制劑后恩替卡韋的藥動學參數Table 2 Pharmacokinetic parameters of entecavir in 20 volunteers after oral dose of test and reference preparations

90%可信區間分別為Cmax94.8%～111.2%,Tmax80.8%～125.0%,AUC0～72 h為97.9～107.2%。測得受試者單次口服試驗制劑恩替卡韋分散片和參比制劑恩替卡韋片的平均相對生物利用度為(103.3±14.0)%，表明2制劑符合生物等效的假設。

3 討 論

3.1研究方法依據 恩替卡韋人體生物等效性研究已有文獻報道[8-10]，但本研究是按照中國藥典(2015版)“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求，建立了HPLC-MS/MS法測定人血漿中恩替卡韋血藥濃度，同時依據中國藥典(2015版)“藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導原則”，以中美上海施貴寶制藥有限公司生產的恩替卡韋片作為參比制劑，評價2種恩替卡韋制劑在健康人體的生物等效性，以期為臨床合理應用恩替卡韋分散片提供參考依據。

3.2分析方法的建立 本研究建立了血漿中恩替卡韋的HPLC-MS/MS測定法，血漿中的雜質不干擾樣本的測定，專屬性好，標準曲線線性范圍為0.05～20.00 μg/L，線性關系良好；LLOQ、低、中、高(0.05、0.1、1.0、15.0 μg/ L)4種不同濃度的批內和批間精密度均<15.0%；相對回收率在97.31%～115.31%之間；恩替卡韋血漿樣品-80～25 ℃下反復凍融3次，-80 ℃下凍存2個月，室溫放置4 h及高氯酸處理后的檢測樣品進樣器放置8 h等條件下的穩定性良好，均符合生物樣品分析要求；采取沉淀蛋白法處理的血漿樣品，LLOQ為0.05 μg/ L，能滿足本研究藥動學數據的需要。

3.3取血時間的設計 研究文獻取血點為0、10、20、30、45 min,1、1.5、2、3、5、8、12、24、36、48、72、96 h[8-14]。一個完整的血藥濃度-時間曲線包括吸收相、分布相和消除相，一般在血藥濃度-時間曲線達峰前至少有4個取血點，本研究經預試驗tmax為30 min，故將30 min前的10 min、20 min 2個時間點改為7 min、14 min、21 min 3個時間點滿足血藥濃度-時間曲線峰前取血點分布要求；根據“藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導原則”采樣時間中：“無論藥物的半衰期多長，采樣周期不必長于72 h”[4]，預試驗結果96 h血藥濃度已經是Cmax的1/20，因此取血時間設計為0、7、14、21、30、45 min，1、1.5、2、3、5、8、12、24、36、48、72 h，縮短了受試者抽血的時間，提高了受試者的依從性，滿足了恩替卡韋人體生物等效性研究要求。

3.4達峰時間 試驗制劑與參比制劑的tmax分別為(0.66±0.19) h和(0.70±0.29) h， 試驗制劑與參比制劑的tmax差異無統計學意義(P>0.05)，但試驗制劑tmax比參比制劑的tmax略有提前，符合分散片遇水迅速崩解形成均勻混懸液的特點,與普通片劑相比，崩解時間短、吸收快，體現了分散片的特征。

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(本文編輯：許卓文)

Studies on human pharmacokinetics and bioequivalence of entecavir dispersible tablet

MA Jie, DONG Zhan-jun*, BAI Wan-jun, SONG Hao-jing, WU Yin, ZHI Xu-ran

(Department of Pharmacy, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China)

ObjectiveTo evaluate the bioequivalence of 2 kinds of entecavir preparations in human bodies.MethodsThe randomized,crossed-over study was conducted in 20 healthy volunteers. After A single oral dose of entecavir hydrochloride test and reference preparations(containing 0.5 mg entecavir), the drug levels in plasma were determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The pharmacokinetic parameters were calculated with DAS 3.2.7 software, then bioequivalence of the two preparations was evaluated.ResultsThe peak concentrations Cmax, tmax, t1/2and AUC0-72 hof the 2 formulations were (4.41±1.02) μg/L and (4.36±0.89) μg/L, (0.66±0.19) h and (0.70±0.29) h, (46.11±32.32) h and (61.28±93.69) h, (13.31±2.63) μg·h-1·L-1and (13.10±2.20) mg·h-1·L-1, respectively.ConclusionThe results show that the two formulations are bioequivalent. The relative bioavailability of entecavir is (103.3±14.0)%.

entecavir; bioavailability; HPIC-MS/MS

2016-10-12；

2016-12-05

馬杰(1962-)，女，山東青島人，河北省人民醫院主任藥師，理學學士，從事臨床藥理學研究。

*通訊作者。E-mail：13313213656@126.com

R969.1；R978.7

A

1007-3205(2016)12-1441-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.12.019