臭氧氧化豬場處理尾水對苦草（Vallisneria spiralis）抗氧化系統的影響

王俊力，陳桂發，劉福興，宋祥甫，鄒國燕

（上海市農業科學院，上海 201403）

臭氧氧化豬場處理尾水對苦草（Vallisneria spiralis）抗氧化系統的影響

王俊力，陳桂發，劉福興*，宋祥甫，鄒國燕

（上海市農業科學院，上海 201403）

為了探索臭氧氧化技術應用于畜禽養殖廢水排放前的預處理對環境可持續發展的影響，用不同濃度臭氧氧化處理經生化工藝處理后的豬場尾水，以苦草為試驗材料，從活性氧代謝和抗氧化系統的角度，探討了沉水植物在臭氧氧化豬場處理尾水中的適應性以及臭氧氧化技術的應用對水生植物的影響。結果表明：與未經臭氧氧化處理相比，臭氧氧化后（AO1 10 mg·L-1、AO2 30 mg·L-1、AO3 50 mg·L-1）豬場處理尾水中苦草的過氧化氫（H2O2）含量有升高趨勢；AO2處理中苦草的抗壞血酸（AsA）-谷胱甘肽（GSH）循環對H2O2調節起重要作用，苦草的抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性、AsA和GSH含量增加，從而使生物量增加；AO3處理中苦草AsA含量降低，H2O2與抗氧化物質之間沒有達到平衡，從而使生物量降低。結果顯示，試驗條件下，30 mg·L-1的臭氧氧化應用于豬場處理尾水，能增強沉水植物的抗氧化系統，促進生長，從而對水生生態系統有調節作用。

臭氧氧化；豬場尾水；沉水植物；苦草；抗氧化系統

我國是世界上畜牧業資源豐富和歷史悠久的國家之一[1]。近年來，我國規模化畜禽養殖業迅速發展，隨之產生的廢物量快速增加[2-3]。豬場廢水排放量大，傳統的生化方法雖然能使豬場廢水達到我國現行畜禽養殖業的排放標準，但已遠遠達不到環境可持續發展的要求，這使人們越來越關注畜禽養殖廢水的深度處理方法。

臭氧氧化可以用于地表水、地下水以及生活和工業廢水的處理和凈化[4-6]，臭氧氧化技術在畜禽養殖廢水方面的應用近幾年也逐漸被重視[3，7-9]。研究表明，臭氧氧化能去除豬場廢水的不良氣味、顏色和無機營養鹽，提高透光率和藻類生物量等[8-9]，還能降低抗生素耐藥菌的生物活性[10]并使殘留細菌引起的微藻小球藻生長量下降[7]。然而，目前國內外對臭氧氧化水處理技術的研究多注重水質的改善，但水處理技術應用的最終目的應該是恢復水體的生態功能[11]，提高水體的自凈能力，因而水處理技術應用后水體的排放對水生生態系統中生物組分的影響研究尤為重要。

臭氧氧化后的豬場廢水中依然存在一些殘留微生物[7]，而且使水體中的溶解氧（DO）[12]、有機物和無機物含量發生變化[9]，造成水體環境的改變。由于環境變化會刺激植物體內產生各種類型的活性氧（ROS），如果抗氧化系統抵御不了ROS的積累，就會使植物受到傷害，那么了解植物的抗氧化代謝特征可能有助于對水處理技術后續影響的研究[13]。水生植物尤其沉水植物在生態系統中具有不可替代的地位和作用，是水質評估和后續風險評價的指示生物[14]。從沉水植物生理水平上探求水環境對植物的影響更能準確地反映植物體的代謝水平和對環境的響應。對沉水植物生理影響的研究，目前多見水體富營養化或重金屬脅迫的報道[15-16]，而臭氧氧化技術的后續影響研究還未見報道，所以用沉水植物抗氧化系統的響應來研究畜禽養殖廢水經臭氧氧化處理后對水生植物的影響具有重要意義。

苦草是一種多年生沉水克隆植物，廣泛分布于我國的各種淡水棲息地[17]，具有良好的實驗特性[18]。本研究以苦草為材料，從其活性氧代謝和抗氧化系統的角度出發，研究經臭氧氧化深度處理后的豬場尾水對苦草生長的影響，探討苦草在豬場處理尾水中的適應性和臭氧氧化技術應用于畜禽養殖廢水對水生生態系統的影響，為臭氧氧化技術在環境可持續發展方面的應用研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地點與材料

本試驗在上海市農業科學院莊行綜合試驗基地（121°23′E、30°53′N）進行。水樣采集于上海市農業科學院畜牧試驗場豬場的排放水池。該場以養殖生豬為主，占地面積3.33hm2，年出欄數3000余頭。豬場廢水主要包括尿、糞和豬舍沖洗水。日產廢水量約5t，排放間隔時間為7d。豬場廢水經生化處理后到達排放水池。本試驗于2015年9—10月進行，每隔7d在排放水池中采水1次，共采集4次，采樣后盡快進行臭氧氧化處理。

臭氧氧化裝置由臭氧發生器（WG-S10，上海威固）、臭氧濃度檢測儀（IDEAL-2000，美國）、不銹鋼增壓泵（JETB-0.37）、文丘里射流器（A25152）和氣液反應器（不銹鋼材質，D 50 cm，H 90 cm）組成。通過臭氧發生器制備臭氧，調節臭氧流量為2.5 L·min-1，由臭氧檢測儀在線檢測臭氧濃度，每次處理的水量固定，設置3個臭氧投加濃度，分別約為10、30、50 mg·L-1，反應時間為30 min，處理時的豬場尾水溫度約為20℃。處理后的水在通風環境中放置24 h，保證無剩余臭氧，然后用于苦草試驗。

苦草（Vallisneria spiralis，常綠品種，購自上海海洋大學）的培育過程在普通池塘中完成，采集長勢和生長量相對一致的幼苗（長度40±5 cm）在圓錐形塑料桶（上口直徑40 cm，下口直徑32 cm，高56 cm）中進行前培育，桶中底泥（采自附近河道）高約15 cm，每個塑料桶中種植苦草7簇，每簇2株，并放入池塘水至淹沒葉片止，每個塑料桶下方20 cm處裝有排水口。待植物苗進入正常的生長階段并有外擴能力后，分別加入未處理和不同臭氧濃度處理的水樣，之后每7 d換一次水，在換水之前采集水樣和植物樣（苦草葉片），進行生理生化指標測定，共采集4次。

本試驗設4個處理，包括3個不同濃度臭氧氧化處理和1個對照，即：BO（Before O3，對照，未經處理的豬場處理尾水）、AO1（AfterO3，臭氧投加濃度為10 mg· L-1）、AO2（After O3，臭氧投加濃度為30 mg·L-1）、AO3（After O3，臭氧投加濃度為50 mg·L-1），分別用于苦草培養，每個處理設3個重復。

加入苦草中的處理水和試驗后水質情況見表1。

1.2 測定指標與方法

超氧陰離子（O-2·）產生速率采用羥胺法測定[19]；過氧化氫（H2O2）含量采用分光光度計法測定[20]；丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法，消光系數為0.155 μmol·L－1·cm－1[21]。

超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）活性采用四唑氮藍（NBT）光氧化還原法測定，以每分鐘每克植物組織（鮮重）的反應體系對NBT光化還原抑制50%為一個SOD活性單位（U）。過氧化氫酶（CAT，EC 1.11.1.6）活性采用紫外吸收法測定，以1 min內A240減少0.1的酶量為一個酶活單位（U）。過氧化物酶（POD，EC 1.11.1.7）活性采用愈創木酚法測定，將每分鐘1個單位的吸光度變化定義為一個POD活性單位（U）[20]。抗壞血酸過氧化物酶（APX，EC 1.11.1.11）活性采用紫外分光光度計測定，消光系數為2.8 mmol·L－1·cm－1）[22]。酶活性（比活）以可溶性蛋白為基礎來表示。可溶性蛋白含量根據Bradford[23]的方法檢測，以牛血清白蛋白（BSA）為標準。抗壞血酸（AsA）含量參照鄒琦[24]的方法測定。谷胱甘肽（GSH）含量參照Griffith[25]的方法測定。

1.3 數據統計與分析

采用SPSS 13.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件進行統計分析，Sigmaplot 12.0軟件完成制圖工作。

表1 加入苦草中和苦草試驗后水質情況Table 1 Water quality before and after Vallisneria spiralis test

2 結果與分析

2.1 臭氧氧化豬場處理尾水對苦草生物量的影響

第4次采樣時，以每個處理3簇統計了苦草葉片干重，4個處理生物量分別為BO 1.63 gDW、AO1 1.83 gDW、AO2 2.44 gDW、AO3 1.15 gDW。從圖1可以看出，AO1、AO2與BO相比，苦草長勢良好，生物量分別增加了12.3%和49.7%，AO3的苦草長勢最弱，生物量與BO相比降低了29.4%。

圖1 苦草形態照片（每處理3簇）Figure 1 The morphology of Vallisneriaspiralis

2.2 臭氧氧化豬場處理尾水對苦草活性氧含量的影響

臭氧氧化豬場處理尾水對苦草O－2·和H2O2的影響如圖2所示。與BO相比，AO2處理的苦草O－2·含量有降低趨勢，但并未達到顯著水平（P＞0.05）；在第1次采樣時，AO1處理的苦草O－2·含量有升高趨勢，并與AO2處理之間達差異顯著水平（P＜0.05，圖2A）。與BO相比，臭氧氧化處理有增加苦草H2O2含量的趨勢，并在第1次采樣中，AO3處理與BO處理之間達差異顯著水平（P＜0.05，圖2B）。臭氧氧化豬場尾水處理對苦草O－2·（P=0.010）和H2O2（P=0.017）含量都有顯著影響（表2）。

2.3 臭氧氧化豬場處理尾水對苦草抗氧化酶防御系統的影響

如圖3A所示，第1次采樣中，與BO相比，AO1和AO2處理中的苦草SOD活性有升高趨勢，但未達到顯著水平（P＞0.05）；在之后的采樣中，臭氧氧化處理有降低苦草SOD活性的趨勢，AO2處理中的苦草SOD活性在第2次采樣中明顯降低，與BO之間達到差異顯著水平（P＜0.05）。與BO相比，臭氧氧化處理中的苦草CAT活性在第1次采樣中有降低趨勢，并且AO3與BO之間達差異顯著水平（圖3B）；而在之后的采樣中，臭氧氧化處理的苦草CAT活性與BO相比有增加趨勢，并且AO3處理與BO之間都達到顯著差異水平（P＜0.05）。

圖2 臭氧氧化豬場處理尾水對苦草活性氧含量的影響Figure 2 Superoxide（，A）production and hydrogen peroxide（H2O2，B）content in Vallisneriaspiralis under piggery tail water of ozonation in four sampling numbers

表2 采樣批次、臭氧氧化處理以及交互作用對苦草生理指標影響的顯著性分析Table 2 P－values for the effects of sampling number，ozonation treatment and their interaction on physiological parameters in Vallisneria spiralis

結合4次采樣來看（圖3C），與BO相比，臭氧氧化處理有降低苦草POD活性的趨勢，且在第2次采樣中，AO2處理的苦草POD活性與BO之間差異顯著（P＜0.05）；第3次采樣中，AO3處理與AO1處理相比POD活性降低明顯（P＜0.05）。臭氧氧化處理有增加苦草APX活性的趨勢（圖3D），且AO2處理增加相對明顯，與BO之間在第3次采樣中達差異顯著水平（P＜0.05）。臭氧氧化豬場尾水處理對苦草CAT（P= 0.007）、POD（P=0.022）和APX（P＝0.003）活性有顯著影響（表2）。

2.4 臭氧氧化豬場處理尾水對苦草抗氧化物質的影響處理之間苦草AsA的變化趨勢在4次采樣中不盡相同（圖4A），與BO相比，臭氧氧化處理在第1和第2次采樣中有增加苦草AsA含量的趨勢，且在第1次采樣中，AO3處理增加相對明顯（P＜0.05），第2次采樣中，AO2處理增加相對明顯（P＜0.05）；在第3和第4次采樣中，AO2處理中苦草AsA含量有增加趨勢，而AO1和AO3處理中苦草AsA含量降低，AO2處理（升高）與AO3處理（降低）之間差異顯著（P＜0.05）。

除第4次采樣外，與BO相比，臭氧氧化處理有增加苦草GSH含量的趨勢。在第1次采樣中，AO1和AO2處理與BO之間達差異顯著水平（P＜0.05）；在第3次采樣中，AO2和AO3處理與BO相比增加明顯（P＜0.05）。從4次采樣樣品平均值來看，AO2處理的苦草AsA和GSH含量與BO處理相比增加明顯，平均分別增加33.3%和14.9%。臭氧氧化豬場尾水處理對苦草AsA（P=0.001）和GSH（P=0.017）含量都有顯著影響（表2）。

3 討論

活性氧（ROS）是植物體內正常代謝的產物。在適宜的濃度下，ROS被認為是信號轉導級聯反應中的第二信使，調節細胞內的幾種植物響應，包括氣孔關閉、程序性細胞死亡及對生物或非生物脅迫的耐性等[26]。高濃度的ROS會對植物產生傷害，使植物過早衰老，而ROS信號的強度、壽命和大小取決于氧化劑的產生和被抗氧化劑清除之間的平衡[13]。·是最重要的氧自由基，也是其他ROS的前體物。本試驗結果表明，臭氧氧化豬場尾水處理并沒有使苦草產生·積累（圖2A），且AO2處理中苦草·含量在4個處理中最低，說明苦草較為適應AO2的環境。相對于H2O2來說·是一個非常不穩定的ROS，可迅速通過歧化作用轉化為H2O2[27]。可以看出（圖2B），臭氧氧化處理中苦草H2O2含量與BO相比有升高趨勢，結合苦草的生物量和長勢（圖1）可以說明，AO1和AO2處理中苦草H2O2含量增加可能起到信號轉導作用，激發體內抗氧化系統發生反應[28]，使其在生長過程中產生獨特的代謝和保護機制[29]，從而維持苦草生長；AO3處理中苦草H2O2含量增加可能使其體內產生了ROS積累，從而影響了苦草生長。

圖3 臭氧氧化豬場處理尾水對苦草抗氧化防御酶活性的影響Figure 3 Superoxide dismutase（SOD，A），catalase（CAT，B），peroxidase（POD，C）and ascorbate peroxidase（APX，D）activities in Vallisneriaspiralis under piggery tail water of ozonation in four sampling numbers

圖4 臭氧氧化豬場處理尾水對苦草抗氧化物質含量的影響Figure 4 Ascorbic acid（AsA，A）and glutathione（GSH，B）content in Vallisneriaspiralis under piggery tail water of ozonation in four sampling numbers

在本試驗中，與BO相比，除第1次采樣外，臭氧氧化處理有降低苦草SOD活性的趨勢（圖3A），且AO2處理降低明顯，這與AO2處理中的O-2·含量低有關（圖2A）；而苦草SOD活性的降低可能是因為SOD發揮了歧化作用，從而使自身活性降低。與BO相比，臭氧氧化處理使苦草CAT活性在第1次采樣中有降低趨勢（圖3B），在之后的采樣中又逐漸升高，說明在試驗初始，苦草對環境產生了不適反應，而在不適條件下苦草會調節自身的內源保護機制，以促進抗氧化酶活性的表達[33]。綜合4次采樣來看，與BO相比，臭氧氧化處理有降低苦草POD活性的趨勢（圖3C），說明臭氧氧化豬場處理尾水環境下，苦草H2O2含量的增加并沒有激發POD活性，POD對苦草的調節沒有起到主要作用，苦草是通過另外的抗氧化途徑來進行ROS調節的。APX是AsA-GSH循環中的關鍵酶[32]，臭氧氧化處理有增加苦草APX活性的趨勢（圖3D），且AO2處理中增加相對明顯，而AO2處理中苦草的生物量也最大，說明與POD相比，可能AsA-GSH循環在本試驗條件下對苦草的ROS調節更有效。

AsA-GSH循環負責清除H2O2，AsA和GSH是AsA-GSH循環中兩個重要的抗氧化物質，它們往往通過相互耦合而起作用。葉片AsA水平被認為是衡量植物耐受性的一個指標[34]。如圖4A所示，在第1次采樣中，AO3處理中苦草AsA含量顯著增加，在之后的采樣中又顯著降低，說明短期處于逆境中時，植物會激發體內的抗氧化物質來抵御不適條件，而之后苦草不能將體內的AsA含量維持在正常水平，可能是在此環境下時間過長對AsA再生系統產生了不利影響[35]，植物體抗氧化脅迫的能力減弱[36]。AO2中苦草的AsA含量較高，說明AsA在調節苦草的適應性和體內的生理平衡上發揮重要作用。GSH是再生AsA的重要物質，是植物代謝過程中生理變化的潛在標記物。臭氧氧化處理有增加苦草GSH含量的趨勢（圖4B），對AsA的再生起到重要作用。在AO2處理中，苦草的APX活性、AsA含量和GSH含量都有增加趨勢，說明AsA-GSH循環在該環境中對苦草的ROS調節和維持生物量具有重要作用。

4 結論

（1）除SOD活性以外，臭氧氧化處理對苦草的活性氧和抗氧化指標均有顯著影響（P<0.05）。

（2）AO1和AO2處理與BO處理相比，苦草的生理指標調節功能相對較好，AO2處理中苦草的生物量最高，AsA-GSH循環對ROS的調節起重要作用，其中的APX活性、AsA和GSH含量增加明顯。

（3）AO3處理中，苦草的H2O2含量增加，AsA含量降低，活性氧和抗氧化指標之間沒有達到平衡，限制了苦草的生長，使苦草生物量降低。

（4）在合適的臭氧氧化濃度條件下，臭氧氧化技術應用于畜禽養殖廢水處理對沉水植物的生長具有促進作用，從而對水生生態系統的調節具有重要意義。

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Effects of ozonation of piggery tail water on the antioxidant system in Vallisneria spiralis

WANG Jun-li,CHEN Gui-fa,LIU Fu-xing*,SONG Xiang-fu,ZOU Guo-yan（Shanghai Academy of Agricultural Science,Shanghai 201403,China）

Ozonation is becoming more prevalent as a pretreatment in the dispose of livestock wastewater,there are growing concerns on the effects of ozonation technology on sustainable development of environment.In this research,after the piggery tail water from biological pond system was further treated by ozonation,the effects of ozonized piggery tail water on the health of aquatic ecosystems were investigated in the terms of reactive oxygen species and antioxidant system of Vallisneria spiralis.The results showed that compared with the un-ozonized tail water,ozonation（AO1 10 mg·L-1,AO2 30 mg·L-1,AO3 50 mg·L-1）increased hydrogen peroxide（H2O2）content in Vallisneria spiralis.AO2 treatment increased ascorbate peroxidase（APX）activity,ascorbic acid（AsA）and glutathione（GSH）content and the biomass,indicating the important role of AsA-GSH cycle in regulating H2O2levels.However,AO3 treatment decreased AsA content,broke the balance between H2O2and antioxidants and resulted in the decreased biomass of Vallisneria spiralis.Our results suggested that,30 mg·L-1is the optimum ozone concentration to treat piggery tail water,by which it could promote the antioxidant system and growth of submerged macrophytes,and very helpful for the maintenance of healthy aquatic ecosystem.

ozonation;piggery tail water;submerged macrophytes;Vallisneria spiralis;antioxidant system

X713

A

1672-2043（2016）12-2299-07

10.11654/jaes.2016-0743

王俊力，陳桂發，劉福興，等.臭氧氧化豬場處理尾水對苦草（Vallisneria spiralis）抗氧化系統的影響[J].農業環境科學學報,2016,35（12）：2299-2305.

WANG Jun-li,CHEN Gui-fa,LIU Fu-xing,et al.Effects of ozonation of piggery tail water on the antioxidant system in Vallisneria spiralis[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（12）:2299-2305.

2016－05－31

國家水體污染控制與治理科技重大專項（2012ZX07101-004）

王俊力（1985—），女，遼寧丹東人，博士，從事植物生理生態研究。E-mail：jlwang2014@yeah.net

*通信作者：劉福興E-mail:liufuxing@126.com