金屬離子對噻嗪酮與小牛胸腺DNA相互作用的影響

朱娜，何婭梅，梁棟，桑楠*

（1.山西大學環境與資源學院，太原 030006；2.中北大學化工與環境學院，太原 030051）

金屬離子對噻嗪酮與小牛胸腺DNA相互作用的影響

朱娜1，何婭梅1，梁棟2，桑楠1*

（1.山西大學環境與資源學院，太原 030006；2.中北大學化工與環境學院，太原 030051）

為探討噻嗪酮及金屬離子共存對非靶標生物遺傳毒性的機制，利用紫外、熒光光譜法研究生理條件下噻嗪酮與小牛胸腺DNA（ctDNA）之間的結合作用大小及模式，從分子水平上分析了Cd2+、Co2+、Cu2+、Ni2+存在時對噻嗪酮與ctDNA相互作用的影響。結果表明：噻嗪酮可與ctDNA結合引起噻嗪酮吸收光譜明顯紅移；可與亞甲基藍（MB）競爭結合ctDNA，且結合常數K隨溫度升高呈遞減趨勢；可與ctDNA以嵌插方式結合使熔點明顯升高。環境金屬離子的存在不會改變噻嗪酮與ctDNA之間的作用模式，但會影響其結合強弱，低濃度Cu2+、Ni2+可通過離子橋表現出一定的促結合作用，高濃度時則引起DNA結構改變而削弱噻嗪酮與DNA的結合，Co2+、Cd2+能影響DNA分子結構、與噻嗪酮競爭結合位點，導致結合常數下降。

噻嗪酮；金屬離子；ctDNA；熒光光譜

對糧食與農業安全的憂慮迫使甲胺磷、久效磷、對硫磷等高毒農藥退出市場，更多的低毒特效產品逐漸成為主流藥物，而濫用農藥導致的藥物殘留也帶來新的環境風險。噻嗪酮（Buprofezin）是一種噻二嗪類昆蟲生長調節劑，對同翅目的飛虱、葉蟬、粉虱及介殼蟲類害蟲有特效，在水稻、茶葉、柑橘、棉花、蔬菜等作物病蟲害防治中發揮著重要作用，屬高效低毒殺蟲劑[1-2]。目前全國每年噻嗪酮原藥總設計產能8000 t左右，實際總產量4500t，且呈逐年遞增趨勢[3]。

據報道菊酯類和噻嗪酮殘留在我國出口茶葉超標農藥中位居前列[4]。南京地區茶葉在用藥7 d后仍殘留約10 mg·kg-1[5]；北京和山東等地番茄與種植土中也發現噻嗪酮的殘留[6]；長沙、杭州、貴陽等地柑橘生產中，噻嗪酮用藥的安全期均在14 d以上[7]。西班牙Almeria地區蔬菜大棚中胡椒、扁豆和茄子等也檢測到噻嗪酮的殘留[8]。因此，應對噻嗪酮引起非靶標生物暴露的環境安全風險引起重視。

重金屬含量超標也是出口農產品中與農藥殘留伴生的主要問題之一，浙江省地方綠茶噻嗪酮殘留最高達600 μg·kg-1，鮮樣中Cu、Cd的平均濃度分別為12.5 mg·kg-1和0.24 mg·kg-1[9-10]。越南湄公河的農業沉積物中不僅發現521 μg·kg-1的噻嗪酮，同時也檢出Ni、Cu、Co等金屬并存[11]；印度與羅馬尼亞的葡萄種植園也分別發現了噻嗪酮和重金屬殘留[12-13]。這些研究結果表明，農產品中金屬與新型農藥殘留形成的復合污染已成為非靶標生物環境暴露及健康風險的重要形式。

流行病學研究表明，在非職業暴露人群血清樣本中噻嗪酮檢出率超出50%[14]；噻嗪酮證實可干擾哺乳動物細胞有絲分裂[15]，引起雄鼠體細胞和生殖細胞染色體畸變[16]；金屬離子也會參與到DNA與藥物的識別和結合過程，對DNA的結構與功能造成損傷[17]。本文以亞甲基藍（MB）為分子探針，通過紫外、熒光光譜法研究生理條件下噻嗪酮與DNA結合模式，同時選取與DNA結合強度不同的4種典型金屬離子（Cd2+、Co2+、Cu2+、Ni2+），探討重金屬對噻嗪酮與DNA結合作用的影響機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：CARY Eclipse 960型熒光分光光度計（Varian），U-3900紫外可見分光光度計（Hitachi），HH-2型恒溫水浴槽（國華電器）。

試劑：小牛胸腺DNA（Solarbio，ctDNA），用0.1 mol·L-1NaCl配制，利用ε=6600 L·mol-1·cm-1確定溶液濃度為1.89×10-4mol·L-1，溶液存于4℃備用。噻嗪酮（以下簡稱Bup）使用無水乙醇配制成濃度為4.92× 10-2mol·L-1貯備液。亞甲基藍（MB）使用三蒸水配制成濃度為1×10-3mol·L-1貯備液。金屬離子（Ni2+、Cu2+、Co2+、Cd2+）均使用三蒸水配制成濃度為4.92×10-2mol· L-1貯備液。

1.2 實驗方法

1.2.1 噻嗪酮-ctDNA紫外光譜測定

在10 mL比色管中，固定Bup的濃度為4.0×10-5mol·L-1，分別加入不同體積的ctDNA溶液（終濃度范圍為6.0×10-5～1.0×10-4mol·L-1），Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，混勻后靜置5 min。掃描200～350 nm紫外吸收光譜，并扣除背景空白。

1.2.2 噻嗪酮、金屬離子對MB-ctDNA熒光光譜的影響

在10 mL比色管中，固定MB和ctDNA的濃度（CMB=1.0×10-5mol·L-1，CDNA=1.89×10-5mol·L-1），分別加入不同體積的Bup溶液（終濃度范圍為4.92×10-6～ 4.43×10-5mol·L-1）或金屬離子溶液（終濃度范圍為2.46×10-6～2.21×10-5mol·L-1），Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，混勻后靜置5 min。以630 nm為激發波長，掃描650～750 nm熒光光譜，并分別記錄25、31、37℃熒光強度變化。

1.2.3 金屬離子對噻嗪酮與MB-ctDNA體系結合常數的影響

在10 mL比色管中，固定MB、ctDNA和金屬離子濃度（CMB=1×10-5mol·L-1，CDNA=1.89×10-5mol·L-1，CMetal=2.46×10-6mol·L-1），改變體系中Bup濃度（終濃度范圍為4.92×10-6～4.43×10-5mol·L-1），Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，混勻后靜置5 min，記錄熒光強度變化。依次改變體系中金屬離子濃度（2.46×10-6～ 3.69×10-5mol·L-1），分別記錄熒光強度變化。

1.2.4 ctDNA熔點實驗

分別移取ctDNA溶液、Bup-ctDNA、Bup-ctDNAMetal溶液于比色杯中，濃度依次為CDNA=5×10-5mol· L-1，CBup=4×10-5mol·L-1，CMetal=7.38×10-5mol·L-1，利用紫外分光光度計記錄20～95℃范圍內溶液在260 nm處的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 ctDNA對噻嗪酮紫外光譜的影響

在pH為7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，噻嗪酮的最大紫外吸收峰為246 nm，此吸收帶主要由噻嗪酮分子結構中含硫氮的芳香雜環π-π*躍遷所引起。隨著體系中ctDNA濃度的增加，最大吸收波長逐漸紅移到257 nm，同時也呈現明顯的增色效應（圖1），說明噻嗪酮與ctDNA之間發生了較強的相互作用。實驗還發現Bup-ctDNA二元體系在最大吸收峰處的吸光度顯著低于單一噻嗪酮與ctDNA吸光度之和，由此可推斷加入ctDNA后，噻嗪酮與DNA發生結合并可能形成基態復合物，改變了原有分子結構中的紫外吸收官能團[18]。

圖1 ctDNA對噻嗪酮紫外光譜的影響Figure 1 The absorption spectra of buprofezin in the presence of ctDNA

2.2 噻嗪酮對MB-ctDNA熒光光譜增強機制及二元結合常數

亞甲基藍（MB）是一種典型的熒光探針，可與DNA以嵌插方式結合。因為噻嗪酮自身熒光較弱，無法直接通過熒光光譜法研究二者作用方式，所以選擇MB為熒光探針，間接考察農藥與DNA之間的相互作用。在MB溶液中加入ctDNA后，前者的熒光強度發生明顯降低（圖2），表明MB-ctDNA體系中由于電子間相互作用引起激發態發光團結構變化而導致熒光猝滅現象的發生。MB-ctDNA體系中加入不同濃度噻嗪酮時，其熒光譜圖如圖2所示。隨著噻嗪酮濃度的增加，體系發生了明顯的增色效應。這是溶液中游離態MB的量增加所導致的[19]，分析可能是由于噻嗪酮結構中有與MB相似的不飽和平面芳環和堿性亞氨基側鏈，能參與競爭MB在ctDNA上的結合位點，致使部分結合到ctDNA上的MB釋放出來，體系熒光增強。

根據熒光增強效應公式：

圖2 噻嗪酮對MB-ctDNA熒光光譜的影響Figure 2 Fluorescence spectra of MB-ctDNA in the presence of buprofezin

式中：F0和Fx分別表示未加入和加入噻嗪酮時體系的熒光強度，F∞為噻嗪酮與DNA相互作用的熒光強度最高值，K為結合常數，[Q]為噻嗪酮濃度。

使用不同溫度下加入噻嗪酮后體系熒光強度變化值1/（Fx-F0）對1/［Q］作圖，由回歸方程計算結合常數K值并列于表1中。比較發現，不同溫度下結合常數K隨溫度升高而略有降低，推斷噻嗪酮可能與MB競爭結合DNA位點，但隨著體系溫度升高，二者結合形成的基態復合物穩定度下降致使K值降低，故該過程應屬于靜態結合[21]。

表1 不同溫度下噻嗪酮與MB-ctDNA結合常數Table 1 The binding constants for the system of buprofezin and ctDNA in different temperatures

2.3 金屬離子對噻嗪酮與MB-ctDNA結合的影響

前期實驗已證實金屬離子、噻嗪酮單獨存在時均未與MB發生結合。固定MB-ctDNA體系中金屬離子濃度，通過調節噻嗪酮濃度可得到三元體系熒光光譜（圖3），結果表明：在Cu2+、Ni2+的存在下，噻嗪酮與MB-ctDNA體系的熒光增強效應顯著，而Co2+、Cd2+存在下，多元體系的熒光強度變化減弱。實驗還比較了不同金屬離子單獨存在時MB-ctDNA體系熒光強度變化（圖3）。通過熒光強度變化值1/（Fx-F0）對1/［Q］作圖，分別計算了金屬離子與MB-ctDNA的結合常數K值（表2）。金屬離子可通過配位作用與DNA雙螺旋內側的堿基和電子基團發生不同程度的結合[22]，隨著體系中金屬離子濃度的增大，部分結合的MB游離出來而增強了體系的熒光強度。

為了進一步探討在復雜環境中不同金屬離子對噻嗪酮與MB-ctDNA結合作用的影響，分別采集了4種金屬在不同濃度條件下的三元體系熒光數據，根據熒光增強公式計算了噻嗪酮與MB-ctDNA體系的結合常數，如圖4所示。結果表明：少量Cu2+可能先與噻嗪酮絡合，再通過離子橋作用與DNA的磷酸基團結合[23]，形成DNA-Bup-Cu2+的復合物，使結合常數明顯增大；隨著Cu2+濃度的增加，由于形成DNA-Bup-Cu2+復合物的空間位阻效應以及使DNA結構松散的鹽效應，不利于噻嗪酮與DNA的結合，導致結合常數略有下降[24]。

表2 不同金屬離子與MB-ctDNA結合常數（K）Table 2 The binding constants for the systems of Cd2+/Co2+/Cu2+/ Ni2+and MB-ctDNA

圖3 金屬離子存在對Bup-MB-ctDNA及MB-ctDNA體系熒光光譜的影響Figure 3 The effects of Cd2+，Co2+，Cu2+，Ni2+on the fluorescence spectra of Bup-MB-ctDNA and MB-ctDNA，respectively

圖4 金屬離子存在對Bup與MB-ctDNA結合常數的影響Figure 4 Effects of metal ions on the binding constant of buprofezin and MB-ctDNA

低濃度的Ni2+可使噻嗪酮與MB-ctDNA體系的結合常數有所上升，而高濃度的Ni2+會使之下降。這是由于Ni2+的結合位點為DNA的磷酸根骨架，噻嗪酮與少量Ni2+協同配合，可增加農藥分子與DNA的結合量；高濃度的Ni2+則會滲透到DNA的堿基對中，與胸腺嘧啶的N3和鳥嘌呤的N1結合，造成DNA磷酸骨架和堿基破壞，進而影響噻嗪酮與DNA的結合[25]。對于Co2+、Cd2+來說，二者均能減弱噻嗪酮與MB-ctDNA間的結合，且K值隨濃度增加而降低。這是由于低濃度的Co2+、Cd2+可能與DNA磷酸基團上的氧原子配位，中和磷氧負離子，使得DNA分子結構收縮，不利于噻嗪酮嵌插到DNA堿基對中；高濃度時則對DNA堿基表現出較強的親和力，可能會與噻嗪酮競爭DNA嘌呤堿基上的N7結合位，導致其結合常數降低[26]。

2.4 金屬離子存在下噻嗪酮對ctDNA熔點的影響

藥物與DNA結合方式的差異，會產生不同的生物學效應，也能直接影響DNA的熔點。如以溝槽或靜電作用與DNA結合的藥物不會影響DNA熔點，但是藥物分子若以嵌插方式結合，則會使DNA的熔點上升5～8℃[27]。通過測定ctDNA、噻嗪酮-ctDNA和噻嗪酮-ctDNA-金屬離子體系的熔點（Tm值），即DNA變性達到50%時的溫度[28]，可以間接確定噻嗪酮與DNA的結合模式以及金屬離子的影響。

根據fss（fss=At/A20，其中At和A20分別為t℃和20℃時體系的吸光度）與溫度響應關系分別測得DNA、Bup-ctDNA和Bup-ctDNA-Metal不同體系Tm值，見表3。結果表明，ctDNA熔點為75.0℃，當加入噻嗪酮后，二元體系熔點升至80.8℃，而加入不同金屬離子后三元體系熔點溫度與二元體系相比變化不大。由此判定，噻嗪酮與ctDNA之間的結合方式為嵌插作用，4種金屬離子的存在并不影響噻嗪酮與ctDNA的結合模式。

表3 不同體系中ctDNA熔點比較Table 3 The melting properties of ctDNA，Bup-ctDNA and Bup-ctDNA-Metal

3 結論

紫外實驗顯示隨著ctDNA濃度變化，噻嗪酮吸收光譜呈現出明顯的增色效應，這提示二者之間有較強的相互作用，并可能通過形成二元復合物引起吸收帶紅移。MB熒光探針和DNA熔點實驗則進一步證明噻嗪酮與DNA之間主要發生嵌插作用。環境中金屬離子的存在并未改變噻嗪酮與DNA之間的作用模式，少量Cu2+、Ni2+可能與DNA的磷酸根結合并通過離子橋協助噻嗪酮與ctDNA的作用，使結合常數呈現一定的增強，但高濃度時所形成的復合物可能影響到DNA的空間結構，削弱噻嗪酮與DNA的結合；Co2+、Cd2+與DNA的配位不僅能改變DNA的分子結構，而且可與噻嗪酮競爭結合DNA上的結合位點，導致結合常數發生明顯下降。

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Interaction properties of buprofezin to calf thymus DNA in the presence of metal ions

ZHU Na1,HE Ya-mei1,LIANG Dong2,SANG Nan1*

（1.Environmental and Resource College,Shanxi University,Taiyuan 030006,China;2.School of Chemical and Environmental Engineering, North University of China,Taiyuan 030051,China）

To illustrate the genetic toxicity mechanism of thiadiazine pesticides on non-target organisms,the interaction between buprofezin and calf thymus DNA（ctDNA）in vitro was investigated by UV-vis absorption spectroscopy and fluorescent spectrometry.The influences of heavy metals（Cd2+,Co2+,Cu2+and Ni2+）on the binding properties were also studied at the molecular level,using methylene blue（MB）as a probe of DNA.The results showed that there was a distinct red shift of absorption spectrum by addition of ctDNA which can be ascribed to the binding interaction between buprofezin and ctDNA.Fluorescent experiments indicated that buprofezin was bound to ctDNA in competition with MB,and the binding constants decreased as a function of temperature.Furthermore,DNA melting-point increment suggested that the binding of buprofezin to ctDNA was an intercalative mode.The presence of metal ions did not change the interaction mode between buprofezin and ctDNA,but influenced the binding intensity of buprofezin to ctDNA.A small quantity of Cu2+and Ni2+showed a promotion between buprofezin and ctDNA via an ionic-bridge mechanism,but a large quantity of ions would modify the structure of ctDNA and weaken the binding capacity.Meanwhile,Co2+and Cd2+could penetrate the ctDNA and competitively bind to ctDNA,resulting in the declination of binding constant.

buprofezin;metal ions;ctDNA;fluorescence spectrum

X171.5

A

1672-2043（2016）12-2314-06

10.11654/jaes.2016-0737

朱娜，何婭梅，梁棟，等.金屬離子對噻嗪酮與小牛胸腺DNA相互作用的影響[J].農業環境科學學報,2016,35（12）：2314-2319.

ZHU Na,HE Ya-mei,LIANG Dong,et al.Interaction properties of buprofezin to calf thymus DNA in the presence of metal ions[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（12）：2314-2319.

2016－05－30

國家青年科學基金項目（21407101，21406211）；國家留學基金委公派訪學項目（201508140049，201608140020）

朱娜（1980—），女，副教授，從事環境化學分析與生態毒理研究。E－mail：zhuna＠sxu．edu．cn

*通信作者：桑楠E－mail：sangnan＠sxu．edu．cn