基于咔唑的雙光子熒光次氯酸根探針光學性質及響應機理

王 昕 張玉瑾 王傳奎

(山東師范大學物理與電子科學學院，濟南250014)

基于咔唑的雙光子熒光次氯酸根探針光學性質及響應機理

王 昕 張玉瑾 王傳奎*

(山東師范大學物理與電子科學學院，濟南250014)

采用含時密度泛函理論與響應函數理論相結合的方法，研究了兩種實驗室新合成的水溶性雙光子熒光次氯酸根(ClO－)探針分子HCH和HCM的單光子吸收、雙光子吸收和熒光發射性質。計算結果表明，HCH和HCM分子與ClO－反應后，生成物的光吸收和光發射性質均發生明顯變化，相應的吸收和發射峰位都發生了明顯藍移，熒光強度展現出明顯的增強。另外，兩探針分子都具有較大的雙光子吸收截面，且與ClO－反應后，生成物的雙光子吸收截面值顯著增加，因此兩分子均可作為性能優良的雙光子熒光探針分子。此外，通過分析HCH和HCM分子與ClO－反應前后的Mulliken電荷布居情況，從理論上證實了該系列熒光探針分子的識別機理是C＝N異構化。

熒光探針；雙光子吸收；次氯酸根；C＝N異構化

1 引言

作為人體內重要的活性氧之一，次氯酸根(ClO－)直接參與生命體眾多的生理過程，在生命活動中發揮著至關重要的作用1－4。一方面，次氯酸根能夠維持細胞內的氧化還原平衡狀態，同時在免疫系統中展現出強大的抗菌能力5,6。另一方面，過量的次氯酸根又會導致組織損傷，并且引發一系列疾病，例如動脈硬化癥、關節炎等7－9。因此，對次氯酸根的探測成為一個重要的研究課題。在諸多的探測方法中，熒光顯微法由于具有高效、靈敏等一系列優勢而被廣泛采用。

近年來，開發新型次氯酸根熒光探針越來越受到人們的關注。Cheng等10設計合成了基于氟硼吡咯的HClO探針，該探針分子的三苯基磷基團能夠靶向活細胞的線粒體，實驗結果顯示，該探針分子能夠對次氯酸實現特異性識別，隨著次氯酸的滴定，溶液展現出肉眼可區分的顏色轉變。Xiao等11以吩噻嗪基團作為熒光團，以季銨化吡啶部分作為線粒體的靶向基團，設計合成了ClO－熒光探針PZ-Py。并利用該探針實現了對巨噬細胞和活體細胞中內源性ClO－的熒光成像檢測。然而，之前所報道的多數次氯酸根探針分子，包括以上提到的兩探針，都是基于單光子激發的熒光探針分子。單光子熒光顯微技術由于短波激發限制了其在深層成像中的應用，并伴有光損傷、光漂白等危害。近幾年來，雙光子熒光顯微因其高選擇性和靈敏度，能夠實時檢測，數據采集簡單快捷，時空分辨率高等優點而被廣泛應用12－18。

近日，Li等19在實驗上合成了基于咔唑的水溶性雙光子熒光探針分子HCH和HCM，兩探針分子均以肟基團作為ClO－的識別基團，利用該系列探針分子能夠實現長波激發下，對ClO－的快速響應、高選擇性識別以及活細胞中ClO－的檢測和生物成像。盡管實驗測量結果顯示HCH和HCM探針分子展現出良好的應用前景，但目前兩探針分子的響應機理尚未得到充分的理論研究。另外，雖然末端烷基基團對探針分子探測性能的影響在實驗工作中得到了討論，但是仍然缺乏相關的理論研究。本文中，采用含時密度泛函理論(TDDFT)和響應理論相結合的方法，系統地研究了實驗室合成的雙光子熒光探針分子HCH和HCM與ClO－反應前后的單、雙光子吸收和熒光發射性質，并在此基礎上通過分析分子體系電荷布居探究了其響應機理。

2 計算方法

本文所使用的理論方法參見文獻20，這里僅給出計算細節。在B3LYP水平上優化了分子的基態幾何結構，基于優化得到的分子基態幾何結構，在密度泛函理論(DFT)/CAM-B3LYP水平上采用響應理論方法計算了分子的單光子吸收性質，包括激發能、激發波長、振子強度和躍遷特性。基于相同的分子基態幾何結構，在DFT/B3LYP水平上計算了分子最低八個激發態的雙光子吸收性質，包括激發能、對應的雙光子吸收波長和雙光子吸收截面。在含時密度泛函理論/B3LYP水平上優化了分子第一激發態的幾何結構并得到了分子的熒光發射性質。其中，分子結構優化是在Gaussian 09程序包21上進行的，同時為了確保優化后結構的穩定性，我們在相同的計算水平上進行了頻率計算；分子單光子吸收、熒光發射性質的計算是在Gaussian 09程序包上進行的，雙光子吸收性質的計算是在Dalton 2013.3程序包22上進行的。以上計算均選用了6-31g**基組，并采用極化連續模型(PCM)來描述周圍的溶劑環境水(H2O)和二甲亞砜(DMSO)對分子光學性質的影響。為了直觀地展現分子電荷分布，我們利用GaussView 5.0做出了分子的靜電勢(MEPs)圖。

3 結果與討論

3.1 分子結構

熒光探針分子HCH和HCM的幾何結構如圖1所示，兩分子都以肟基團作為ClO－的識別基團，而其吡啶所連的末端基團分別為己基和甲基。探針分子HCH和HCM與ClO－反應后，肟基團發生氧化脫氫作用生成氧化腈，碳氮雙鍵被氧化成碳氮三鍵，對應的生成物分別為HCH-CNO分子和HCM-CNO分子。

表1給出了水溶液中，分子優化后的部分鍵長和二面角情況。HCH分子的C1―N2鍵長為0.149 nm，將HCH分子吡啶所連的末端基團己基替換成甲基，即在HCM分子中，C1―N2鍵長縮短為0.148 nm。當兩探針分子分別與ClO－反應后，

C10―C11、 C11＝/≡N12、 N12―O13的 鍵 長 分 別 由0.147、0.128、0.139 nm縮短為 0.143、0.117、0.123 nm，這是由于ClO－使末端肟基團發生氧化脫氫作用引起結構上的變化而造成的。探針分子HCH和HCM的吡啶平面與咔唑平面間的二面角分別為179.564°和179.428°，與ClO－反應后，對應二面角分別為179.821°和179.652°。可見兩探針分子均具有較好的平面性，并且與被探測底物作用以后，分子體系的平面性得到了增強，另外與HCM分子和HCM-CNO分子相比，HCH分子和HCHCNO分子對應的平面性更好一些，這有利于分子內電荷轉移的發生，因此推測HCH分子具有更強的光吸收性質。

圖1 探針分子HCH,HCM的幾何結構示意圖及與ClO－反應過程Fig.1 Geometric structures of probe molecules HCH,HCM and reaction process for sensing ClO－

表1 水中分子優化后的部分鍵長和二面角Table 1 Selective bond lengths and dihedral angles of the optimized compounds in H2O

3.2 單光子吸收性質

表2 分子在低能量范圍內的單光子吸收性質,包括激發能(Eopa)、對應的吸收波長(λopa)、振子強度(δopa)和躍遷特性Table 2 One-photon absorption properties of the compounds in lower energy region,including the excitation energy(Eopa),the corresponding absorption wavelength (λopa),the oscillator strength(δopa),and the transition feature

表3 水中分子的前線軌道能量Table 3 Frontier orbital energies of the compounds in H2O

3.3 雙光子吸收性質

表4給出了在DMSO溶液中分子最低八個激發態對應的激發能、雙光子吸收波長和雙光子吸收截面。在低能量范圍內，兩探針分子HCH、HCM的最大雙光子吸收均發生在第六激發態，其最大雙光子吸收截面分別為1421、1207 GM，對應的雙光子吸收峰位于618、621 nm處。與ClO－反應后，生成物HCH-CNO、HCM-CNO分子的最大雙光子吸收均發生在第八激發態，其最大雙光子吸收截面分別為2824、2427 GM，對應的雙光子吸收峰位于600、603 nm處。兩探針分子HCH、HCM在與ClO－反應后，最大雙光子吸收波長均藍移了18 nm，最大雙光子吸收截面值顯著增加，分別增加了1403、1220 GM。值得注意的是，與HCM-CNO分子相比，HCH-CNO分子的最大雙光子吸收截面較大，這與實驗測量結果定性一致19。

表4 分子在DMSO溶液中最低八個激發態的激發能(Etpa)、對應的雙光子吸收波長(λtpa)以及雙光子吸收截面(σtpa)Table 4 Excitation energy(Etpa),the corresponding two-photon absorption(TPA)wavelength(λtpa),and the TPAcross section(σtpa)of the lowest eight excited states for the compounds in DMSO solvent

表5給出了所研究的分子體系在水溶液中的雙光子吸收性質，從表中可以看到，在水溶液中HCH和HCM分子的最大雙光子吸收截面分別為1479、1265 GM，對應的雙光子吸收波長分別位于623、621 nm處，而加入ClO－以后，分子體系的最大雙光子吸收截面增加到2825和2501 GM，對應的吸收波長分別藍移到599、602 nm處。其中，HCH和HCM分子在水溶液中的最大雙光子吸收截面比在DMSO溶液中的最大雙光子吸收截面均增大了58 GM，這是由于溶劑效應導致的。在同種溶劑中，HCH分子的最大雙光子吸收截面大于HCM分子的最大截面，可見末端烷基長度的增加可以提高分子的雙光子吸收截面，這與實驗測量結果在趨勢上是吻合的。而與實驗測量得到的HCH-CNO和HCM-CNO分子的最大雙光子吸收截面1642、980 GM相比較，理論計算的數值偏大，這主要是由于目前的理論研究忽略了光場和分子間相互作用及分子的振動對雙光子吸收截面的影響。

表5 分子在水中最低八個激發態的激發能、對應的雙光子吸收波長以及雙光子吸收截面Table 5 Excitation energy,the corresponding two-photon absorption wavelength,and the TPAcross section of the lowest eight excited states for the compounds in H2O

以上計算結果表明，兩探針分子HCH和HCM均具有較大的雙光子吸收截面，并且與ClO－反應后，分子的最大雙光子吸收截面有不同程度的增大，這意味著兩分子均可作為較好的雙光子熒光探針，此外以己基作為吡啶所連的末端基團的HCH分子具有更大的雙光子吸收截面，并且與反應后分子的雙光子吸收能力增強更為明顯，因此可以預測該分子可作為性能更優的雙光子熒光探針。

3.4 熒光性質

Li等19在實驗上給出了探針分子探測前后的發射波長變化情況，結果表明隨著的不斷滴定，含有HCH分子和HCM分子的溶液分別在546、544 nm處展現出增強的熒光發射峰。理論計算得到的分子發射能量、對應的熒光波長、振子強度、躍遷特性以及由Einstein躍遷幾率公式23得到的熒光壽命在表6中列出。可以看到，HCH、HCM分子在水溶液和在DMSO溶液中的熒光發射峰位分別位于589、592 nm處和593、596 nm處，對應的熒光發射強度分別為0.59、0.56 a.u.和0.57、0.54 a.u.，與ClO－反應后，HCH-CNO、HCM-CNO分子在水溶液和在DMSO溶液中的熒光發射峰位分別藍移到了550、553 nm處和553、557 nm處，對應的熒光發射強度增強到了0.77、0.72 a.u.和0.73、0.68 a.u.。ClO－的加入使得體系熒光強度增強，這與實驗結果定性一致，說明這兩分子均可作為性能優良的熒光探針。

熒光壽命是衡量探針性能的重要參數，與反應前的分子體系HCH和HCM分子相比，HCHCNO和HCM-CNO分子在水溶液和在DMSO溶液中的熒光壽命均發生了不同程度的縮短，因此與探測底物反應以后，分子發出的熒光信號更容易被探測到，這同樣證明了兩分子均可作為性能優異的熒光探針。另外，HCH和HCH-CNO分子具有比HCM和HCM-CNO分子更短的熒光壽命，因此HCH分子可作為性能更優的熒光探針分子。

表6 分子在低能量范圍內的發射性質，包括發射能(Eope)、對應的發射波長(λope)、振子強度(δope)、躍遷特性和熒光輻射壽命(τ)Table 6 Emission properties of the compounds in lower energy region,including the emission energy(Eope),the corresponding emission wavelength(λope),the oscillator strength(δope),the transition feature and the emission lifetime(τ)

3.5 響應機理

分子體系的光學性質強烈依賴于電荷分布情況，因此為了探究探針分子的響應機理，我們進一步理論計算了分子在基態和電荷轉移態的Mulliken電荷分布以及在兩態之間的電荷轉移情況，為了更清晰地展示結果，我們將所研究的分子體系分為三個部分(見圖1)。A部分和C部分為分子的末端基團，B部分為分子共軛橋部分。表7列出了各部分基態和電荷轉移態的Mulliken電荷分布以及在兩態之間的電荷轉移情況。由表中數據可以看到，在基態時，HCH分子和HCM分子的A、B、C部分的電荷量均為0.917e、0.112e、－0.029e，與ClO－反應后，生成物HCH-CNO分子和HCM-CNO分子A、B、C部分的電荷量分別為0.927e、0.318e、－0.245e和0.926e、0.318e、－0.244e，可見ClO－的加入使得識別基團肟中的碳氮雙鍵被氧化為碳氮三鍵，末端基團由―OH變為―O－，進一步影響了分子體系的電荷分布和光學性質。為了直觀地看到結合對兩探針分子電荷分布的影響，我們做出了分子的MEPs。如圖2所示，與反應后，HCH分子和HCM分子C部分的負電荷密度稍有增大，且兩探針分子在反應前后的正電荷密度都主要分布在A部分。對于兩探針分子HCH和HCM，電荷分布的變化是由分子末端基團中C＝N鍵的結構變化引起的。之前的一些報道發現，當化合物分子中含有C＝N鍵時，C＝N異構化會加劇分子的激發態的非輻射躍遷，成為激發態能量主要的衰減途徑，從而使得分子熒光淬滅；當通過橋鍵將C＝N鍵固定以后，C＝N異構化會受到抑制，從而使得分子的熒光恢復24－27。因此該系列探針分子的響應機理可歸于ClO－的加入使得C＝N異構化被抑制，進而導致了熒光信號的增強。

第一激發態構型下，探針分子HCH和HCM中A、C部分的電荷量較基態構型下的電荷量增加到0.784e、－0.103e和0.783e、－0.103e，而B部分的電荷量分別減小到0.319e、0.320e，因而A、C部分均表現出得電子的能力，而B部分表現出失電子能力。與ClO－反應后，生成物HCH-CNO和HCMCNO在第一激發態構型下A、B、C基團電荷量分別為0.789e、0.480e、－0.269e和0.788e、0.481e、－0.269e。需要注意的是，探針分子與ClO－反應前后從基態到第一激發態的電荷轉移量發生了較大變化。與探針分子HCH相比，HCH-CNO分子B基團的供電荷量由0.207e減小到0.162e，C基團的得電荷量由0.074e減小到0.024e。與探針分子HCM相比，HCM-CNO分子B基團的供電荷量由0.208e減小到0.163e，C基團的得電荷量由0.074e減小到0.025e。以上結果表明，ClO－的加入使得肟基團中的碳氮雙鍵被氧化為碳氮三鍵，同時―OH變為―O－，因而改變了體系激發過程中的電荷轉移情況。

表7 分子在基態和電荷轉移態下A、B、C三部分的Mulliken電荷量以及兩態之間的電荷轉移量Table 7 Mulliken charges of groupsA,B and C of compounds for the charge-transfer state and ground state and their charge difference

圖2 分子的靜電勢圖Fig.2 Diagram of molecular electrostatic potential

4 結論

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Optical Properties and Responsive Mechanism of Carbazole-Based Two-Photon Fluorescent Probes for the Detection of Hypochlorite

WANG Xin ZHANG Yu-Jin WANG Chuan-Kui*
(School of Physics and Electronics,Shandong Normal University,Jinan 250014,P.R.China)

The one-and two-photon absorption and emission properties of the two newly synthesized watersoluble two-photon fluorescent probes(HCH and HCM)for the detection of ClO－were investigated using timedependent density functional theory in combination with response theory.Dramatic changes in the photophysical properties of the molecules following reaction with ClO－were predicted.The photoabsorption and photoemission peaks for both compounds were clearly blue shifted,while the emission intensities were enhanced.Both probes were also found to have large two-photon cross sections.Importantly,in the presence of ClO－the two-photon cross section of the molecules increased significantly,which indicated that both HCH and HCM should be good two-photon fluorescent probes for sensing ClO－.The responsive mechanism of the probes was explored by analyzing the molecular Mulliken charge population,which was attributed to C＝N isomerization.

Fluorescent probe;Two-photon absorption;ClO－;C＝N isomerization

O644；O641

10.3866/PKU.WHXB201609301

Received:June 6,2016;Revised:September 30,2016;Published online:September 30,2016.

*Corresponding author.Email:ckwang@sdnu.edu.cn;Tel:+86-531-86180892.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(11404193),Natural Science Foundation of Shandong Province, China(ZR2014AM026),and Taishan Scholar Project of Shandong Province,China.

國家自然科學基金(11404193),山東省自然科學基金(ZR2014AM026)和山東省泰山學者資助項目