固相萃取-高效液相色譜法測定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑

徐秋生 劉 俊 賀慧琳 吳愛紅

(平湖市食品藥品檢測中心，平湖 314200)

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固相萃取-高效液相色譜法測定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑

徐秋生 劉 俊 賀慧琳 吳愛紅

(平湖市食品藥品檢測中心，平湖 314200)

建立了采用固相萃取-高效液相色譜法測定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑(除蟲脲、滅幼脲、殺鈴脲、氟鈴脲、氟苯脲和氟啶脲)的方法。蔬菜樣品用乙腈均質法提取鹽析后脫水，經Florisil固相萃取柱凈化，正己烷/丙酮(85/15，V/V)淋洗，洗脫液濃縮定容后經液相色譜分離與檢測，外標法定量。結果表明，各組分農藥的加標回收率在83.5%～105.6%之間，變異系數(CV)在3.05%～9.56%之間，最低檢出限0.02～0.04mg/kg，滿足蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑的檢測要求。

固相萃取 高效液相色譜 蔬菜 敵菌靈 苯甲酰脲類殺蟲劑

敵菌靈是由三聚氰酰氯與鄰氯苯胺在脫酸劑存在下作用而得到的一種殺菌劑，其化工產品學名為2，4-二氯-6-(鄰氯代胺基)均三氮苯，具有低毒、內吸性和殺菌譜較廣等特點[1]，對交鏈孢屬、尾孢屬、 葡柄霉屬、葡萄孢屬等真菌特別有效，廣泛用于糧食、蔬菜等農作物，防治水稻胡麻葉斑病，瓜類的炭疽病、霜霉病、黑星病和各種農作物的灰霉病。苯甲酰脲類殺蟲劑屬幾丁質合成抑制劑，主要通過抑制昆蟲蛻皮，變態導致不育及直接殺卵等作用來控制害蟲的繁衍[2]。目前在用的主要有除蟲脲、滅幼脲、殺鈴脲、氟鈴脲、氟苯脲和氟啶脲等，該類農藥與有機磷、氨基甲酸酯、菊酯類等殺蟲劑之間無交互抗性且防蟲效果更佳，在糧食、蔬菜等農作物得到廣泛應用[3]。近年來隨著現代農業和社會的發展，各類農藥在農作物生長過程中的廣泛使用，不可避免帶來農藥殘留問題以及對人類在存潛在的危險，農藥殘留危害已引起更多人的關注，世界先進國家和地區都制定了嚴格的農藥殘留限量標準，包括CAC、歐盟、美國和日本均有現行標準，我國在GB 2763-2014《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》[4]中對于敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑作了明確的限量規定。

農藥殘留分析的樣品種類繁多，化學組成復雜，要使分析儀器能檢測到痕量的殘留農藥，必須對樣品進行必要的提取、濃縮和凈化處理[5]。固相萃取是近年發展起來一種樣品預處理技術，由液固萃取和柱液相色譜技術相結合發展而來，能有效的將分析物與干擾組分分離，減少樣品預處理過程，操作簡單、省時、省力，現已廣泛應用于農藥殘留的分析中[6]。目前，測定糧食、蔬菜中敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑農藥殘留量的檢測方法報道比較多，主要包括高效液相色譜法[7，8]、高效液相色譜質譜聯用法[9]和氣相色譜質譜聯用法[10]等，但這些檢測的報道多以敵菌靈或苯甲酰脲類殺蟲劑單一品種農藥進行檢測，同時測定蔬菜中敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑農藥殘留的研究尚未見報道。本實驗建立了采用固相萃取-高效液相色譜法測定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑的分析方法，并做了方法確認實驗，為快速檢測蔬菜中敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑農藥殘留進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

敵菌靈、除蟲脲、滅幼脲、殺鈴脲、氟鈴脲、氟苯脲、氟啶脲標準品(純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer)；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷(色譜純，德國Merck)；氯化鈉(分析純，國藥集團)；Cleanert Florisil柱(1000mg/6mL，天津Agela)；Cleanert Alumina-N柱(1000mg/6mL，天津Agela)；WondaSep Si硅膠小柱(500mg/6mL，日本島津)；有機微孔濾膜(0.22μm，天津Agela)；超純水(實驗室自制)。

UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國，Thermo Fisher公司)；TurboVapLV型全自動定量濃縮儀(瑞典，Biotage公司)；T25高速均質機(德國，IKA公司)；LD4-2A離心機(北京醫用離心機廠)；Milli-Q Advatantage A10超純水機(法國，Merck Millipore公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別準確稱取敵菌靈、除蟲脲、滅幼脲、殺鈴脲、氟鈴脲、氟苯脲和氟啶脲7種農藥標準品10mg至10mL的棕色容量瓶中，用甲醇配成濃度約為1000 mg/L單標標準貯備液，-18℃保存，備用。吸取7種單標農藥標準貯備液適量，置于棕色容量瓶中，用甲醇稀釋成濃度為25mg/L農藥混合標準溶液，-18℃保存，備用。

1.2.2 樣品前處理

稱取粉碎均勻的蔬菜試樣15 g(精確至0.01 g)于100 mL聚丙烯(PP)塑料離心管中，加入30.0mL乙腈，均質機高速均質2min，4000r/min離心5min，取上清液倒入預先稱取3～5g氯化鈉的100 mL聚丙烯(PP)塑料離心管中，蓋上塞子，劇烈振蕩1min，靜置30min，使乙腈相和水相充分分層。從離心管中吸取10.0mL乙腈溶液至15mL玻璃樣品管中，置于全自動定量濃縮儀80℃水浴氮吹蒸發近干，加入2.0mL正己烷渦旋混勻待凈化。依次用5.0mL正己烷/丙酮(85/15，V/V)淋洗液和5.0mL正己烷預淋洗Florisil(1000mg/6mL)小柱，棄去流出液，當正己烷液面層到達柱吸附層表面時，立即移入待凈化樣品液，用15mL玻璃樣品管接收洗脫液，5.0mL正己烷/丙酮(85/15，V/V)洗脫液清洗樣品管后淋洗小柱，并重復兩次。將盛有洗脫液樣品管置于全自動定量濃縮儀上，水浴50℃氮吹蒸發近干，加入2.0mL甲醇渦旋混勻，過0.22μm有機微孔濾膜，上液相色譜測定。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相A為乙腈，流動B為水，洗脫程序0～20min，A從45%線性增加至100%， 20～22min保持A為100%，22～24min A線性減少至45%，23～30min保持A為45%；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；檢測器：二極管陣列(DAD)；紫外檢測波長：250 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

取農藥混合標準溶液，上機分析，在190nm～400nm范圍內進行波長掃描，獲得7種農藥的紫外吸收光譜重疊圖(見圖1)，從光譜圖上可以看出7種農藥在250 nm～260nm波長范圍內均有較強紫外吸收峰，綜合比較后選擇260nm為本方法的色譜檢測波長。

2.2 提取溶劑的選擇

在農藥殘留分析中，乙腈、丙酮和乙酸乙酯是3種常用的提取溶劑，本實驗選擇黃瓜空白樣品中添加農藥混合標準溶液，測定各組分農藥的回收率，比較了3種提取溶劑的提取效率，結果見圖2。由圖2可見，3種溶劑的回收率均能滿足農殘分析要求，但是與乙腈相比較，丙酮和乙酸乙酯溶出的雜質和色素較多，對后續的凈化處理有較大的影響。本實驗最終選用乙腈作為提取溶劑，7種農藥回收率均在90%以上。

2.3 凈化方式的選擇

農藥殘留分析常用的前處理方法有液-液萃取(MLLE)、固相萃取(SPE)、超臨界流體萃取(SFE)和凝膠滲透(GPC)等，本實驗選用固相萃取法比較了Cleanert Florisil柱、WondaSep Si柱和Cleanert Alumina-N柱3種不同固相萃取柱對于黃瓜空白樣品的凈化效果及回收率，從圖3中可以看出3種固相萃取柱回收率都能滿足農殘分析要求，相比較Cleanert Florisil柱和Cleanert Alumina-N柱的回收率優于WondaSep Si柱，實驗最終選擇傳統的Florisil柱作為凈化用固相萃取柱。

2.4 標準曲線與檢出限

吸取農藥混合標準溶液，用甲醇逐級稀釋配制成濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0mg/L系列標準工作溶液，上機測定，以標準工作溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。用甲醇逐級稀釋各組分農藥標準溶液，以3倍信噪比(S/N)計算最低檢出限，結果見表1。從表1可見，7種農藥在0.05～5.0 mg/L濃度范圍內線性關系良好，線性相關系數均大于0.999。

2.5 加標回收率與精密度試驗

稱取粉碎均勻的黃瓜空白試樣15 g(精確至0.01 g)，分別添加0.04mg/kg、0.1mg/kg和1.0mg/kg 3個不同水平的農藥混合標準溶液，按上述條件進行前處理，測定樣品中各組分農藥的含量，每個添加濃度重復測定6次，計算加標回收率和變異系數(CV)，結果見表2。各組分農藥的加標回收率在83.5%～105.6%之間，變異系數(CV)在3.05%～9.56%之間，符合農藥殘留分析要求。黃瓜空白樣品和黃瓜加標樣品的色譜圖見圖4、圖5，由色譜圖可見，經過Florisil柱凈化后色素能被有效吸附，在上述色譜條件下，各組分農藥分離較好，無雜質干擾，能夠滿足敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲農藥殘留的檢測。

表2 回收率與精密度試驗(n=6)

2.6 蔬菜樣品的測定

采用本方法對某蔬菜批發市場銷售的不同品種的蔬菜樣品進行了敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲7種農藥殘留的檢測，每個品種選擇了3個不同的基質，并用二極管陣列(DAD)檢測器收集紫外譜圖進行定性分析，檢測結果見表3。由表3可見，氟鈴脲和殺鈴脲2種農藥在被檢蔬菜樣品中未檢出，其余5種農藥均有檢出，但符合GB 2763-2014《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[4]最大殘留限量要求。

表3 蔬菜樣品中7種農藥殘留檢測結果 mg/kg

3 結論

采用固相萃取-高效液相色譜法測定蔬菜中殘留的敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑，各組分農藥的加標回收率在83.5%～105.6%之間，變異系數(CV)在3.05%～9.56%之間，符合農藥殘留分析要求，方法操作簡單快速，準確可靠，使用本方法完全可以滿足蔬菜中敵菌靈和苯甲酰脲類殺蟲劑的日常檢測要求。

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[2] 何康.中國農業百科全書:農藥卷.北京:中國農業出版社,1993:10.

[3] 何紅梅,吳俐勤,章虎,等.蔬菜中苯甲酰脲類藥物殘留的測定方法研究[J].分析化學,2006, 34(10):1379-1383.

[4] GB 2763-2014 食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量[S].

[5] 劉士華,王興征,侯淑云,等.農藥殘留檢測前處理步驟及其質量控制[J].北京農業,2014(15): 5-6.

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Determination of anilazine and benzoylurea insecticides pesticide residues in vegetables by solid phase extraction and high performance liquid chromatography.

Xu Qiusheng, Liu Jun, He Huilin ,Wu Aihong

(PinghuFoodandDrugInspectionCenter,Pinghu314200,China)

The sample was homogeneously extracted by acetonitrile with salting out and dehydration. After purification on the Florisil solid phase extraction column, eluted with Hexane/Acetone (85/15,V/V), the eluent was concentrated and diluted for high performance liquid chromatography analysis,measured by the external standard.The results showed that the recoveries of pesticides were between 83.5%-105.6%, and the coefficient of variation(CV) ranged from 3.05% to 9.56%, the lowest detection limit was 0.02-0.04mg/kg. The method can meet the detection requirements of anilazine and benzoylurea insecticides residues in vegetables.

solid phase extraction; high performance liquid chromatography; vegetables; anilazine; benzoyllurea insecticides

徐秋生,男，1979年出生，工程師,研究方向:食品、農產品儀器分析與測試，E-mail: xuqsh@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.005

2016-05-23