HPLC法測定烏龍茶中6種兒茶素類成分含量

韋 杰 周璐煒 何金蓮 謝 靜

(成都醫學院藥學院，成都 610083)

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HPLC法測定烏龍茶中6種兒茶素類成分含量

韋 杰 周璐煒 何金蓮 謝 靜*

(成都醫學院藥學院，成都 610083)

采用HPLC外標法測定烏龍茶中沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、沒食子基兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子酰表兒茶素(ECG)等6種兒茶素類化合物的含量。選用Shimadzu Wonda Cract ODS-2色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動相為0.5%乙酸水溶液(A相)、乙腈(B相)，梯度洗脫：0～40 min從10% B線性上升至30% B；流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為280 nm，柱溫為35 ℃。結果表明5種不同品牌的烏龍茶中EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的含量分別為19.5～85.3 mg/g、152.9～376.5 mg/g、4.7～19.2 mg/g、39.4～181.9 mg/g、10.0～74.3 mg/g和15.4～64.2 mg/g，本方法可以準確地測定烏龍茶中的6個指標成分的含量，為烏龍茶質量評價提供依據。

烏龍茶 兒茶素 高效液相色譜法

烏龍茶是中國六大茶系之一，屬于半發酵茶，既有綠茶的清香，又有紅茶的濃郁。烏龍茶的藥理作用，不但突出表現在具有分解脂肪、減肥健美的效果[1]，還有緩解心血管疾病、降膽固醇、抗氧化、抗菌、抗癌、降血糖等作用[2-5]。烏龍茶含有多種有機化學成分和無機礦物元素功效成分，其中最重要、含量最高的是兒茶素類化合物，主要包括表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、兒茶素(catechin，C)、表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表兒茶素(epicatechin，EC)、沒食子基兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate，GCG)、沒食子酰表兒茶素(epicatechin gallate，ECG)等，這6個兒茶素類化合物被認為是烏龍茶的主要活性成分[6]。目前，尚無對這6個成分進行定量分析的報道，為更全面地評價烏龍茶的品質，本研究開發了一個新的HPLC方法對烏龍茶中6種兒茶素成分的含量進行了定量測定。

1 材料與方法

1.1 材料

超聲波清洗器(KH5200B，昆山禾創超聲儀器有限公司)；分析天平(GA110，Ohaus)、移液器(KA0004731：100～1000 μL，KE0040836：10～100 μL)，島津高效液相色譜系統(包含LC-20AD二元高壓泵、DGU-20A3R自動脫氣機、SIL-20A自動進樣器、MSD-M20A二極管陣列檢測器)。6個對照品表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表沒食子基兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、沒食子基兒茶素沒食子酸酯(GCG)、沒食子酰表兒茶素(ECG)購買于成都普思生物科技股份有限公司，使用娃哈哈純凈水和色譜純乙腈作為洗脫溶劑，其它試劑均為分析純，5個烏龍茶樣品均為市售商品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Shimadzu Wonda Cract ODS-2(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。流動相為0.5%乙酸水溶液(A相)、乙腈(B相)，梯度洗脫：0～40 min從10% B線性上升至30% B；流速為1.0 mLmin-1，檢測波長為280 nm，柱溫為35 ℃。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，理論塔板數以兒茶素峰計不低于12000。

1.2.2 對照品儲備液的制備

分別取一定量的EGC、C、EGCG、EC、GCG、ECG購對照品，精密稱量，用50%甲醇溶解配成相應的對照品儲備液：EGC 6.2 mg/mL、C 5.1 mg/mL、EC 9.5 mg/mL、EGCG 4.9 mg/mL、GCG 4.9 mg/mL、ECG4.7 mg/mL，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 樣品溶液的制備

取60 mg烏龍茶粉末，精密稱量，至25 mL容量瓶中，加50%甲醇超聲提取15 min，重復一次，合并提取液，定溶至50 mL，搖勻，0.45 μm濾過，即得。

1.2.4 線性關系

將對照品儲備液按照25∶15∶6∶30∶8∶15的比例混合，得到混標工作溶液I，將其逐級稀釋得到混標工作溶液Ⅱ～Ⅴ。分別吸取混標工作溶液I～Ⅴ10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 重復性試驗

取同一烏龍茶粉末6份，精密稱量，分別按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按照“1.2.3”項下色譜條件測定，計算重復性試驗結果。

1.2.6 回收試驗

取同一烏龍茶粉末9份，精密稱量，分為3組，每組緊密加入相當于已知含量50%、100%和150%的對照品儲備液，分別按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按照“1.2.3”項下色譜條件測定含量，計算加樣回收率。

1.2.7 樣品測定

分別取不同品牌的烏龍茶樣品，按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，將供試品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖。

2 結果與討論

2.1 分析條件的選擇

本試驗比較了多種溶劑洗脫系統，包括乙腈-水、甲醇-水、乙腈-酸性水溶液、甲醇-酸性水溶液，結果表明甲醇系統的基線漂移較為顯著，而酸性水溶液的使用可以避免色譜峰拖尾，提高對稱性，因此最終采用乙腈-0.5%乙酸水溶液作為流動相。對于檢測波長選擇，210 nm處色譜圖的基線漂移非常嚴重；而對樣品在200～400 nm全掃描，可發現EGCG、GCG和ECG在280 nm處有一個明顯的強吸收，如圖1所示。

雖然EGC、C、EC在280 nm的吸收強度不如250 nm處，但是考慮到280 nm處的基線更加平穩，因此選擇280 nm作為檢測波長。本試驗嘗試了不同的柱溫(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)和不同的流速(0.8 mLmin-1、1.0 mLmin-1、1.2 mLmin-1、1.4 mLmin-1)對分離的影響，結果表明，柱溫和流速雖然會使色譜峰整體移動，但對色譜峰的峰形和分離度影響不大，綜合考慮，最終選擇35 ℃作為柱溫，流速為1.0 mLmin-1。綜合上述篩選，確定色譜條件，對照品和樣品色譜圖如圖2所示。

2.2 方法學考察結果

結果表明，6個兒茶素類對照品線性關系良好，標準曲線分別為：EGCy= 6164824x- 86223,r2=0.9992；Cy= 2390074x+ 33789,r2=0.9995；ECy= 5080708x+ 5066,r2=0.9995；EGCGy= 6161781x- 83967,r2 =0.9993；GCGy= 4750767x- 4905,r2=0.9994；ECGy= 5545450x+ 2810,r2 =0.9998；對同一烏龍茶的6份樣品重復性試驗結果表明重復性良好，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的RSD分別為：2.28%、1.02%、1.62%、1.42%、1.95%和0.91%；對同一烏龍茶的9份樣品進行加樣回收實驗，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的平均回收率(n=9)分別為：99.06% (RSD=2.84%)、99.08% (RSD=1.68%)、99.32% (RSD=1.96%)、99.20% (RSD=2.04%)、99.49% (RSD=2.19%)、99.29% (RSD=1.88%)。方法學考察結果說明本方法滿足定量分析的要求，準確可靠，可以用于烏龍茶樣品中兒茶素類化合物的含量測定。

2.3 樣品測定結果

按外標法計算樣品中兒茶素的含量(表1)，所測定的5種不同品牌的烏龍茶中EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG的含量分別為19.5～85.3 mg/g、152.9～376.5 mg/g、4.7～19.2 mg/g、39.4～181.9 mg/g、10.0～74.3 mg/g和15.4～64.2 mg/g。通過對烏龍茶中6種指標成分的準確定量，分析各批樣品成分含量差別，可為烏龍茶質量評價提供依據。

表1 不同烏龍茶樣品中兒茶素含量測定結果 mg/g

[1] Zhu J C, Chen F, Wang L Y, et al. J Agri Food Chem, 2015, 63(34): 7499-7510.

[2] Hosoda K, Wang M F, Liao M L, et al. Diabetes Care, 2003, 26(6): 1714-1718.

[3] Zhang X, Wu Z F, Weng P F. J Agri Food Chem, 2014, 62(41): 10046-10054.

[4] Zhu Q Y, Hackman R M,Ensunsa J L,et al. J Agri Food Chem, 2002, 50(23): 6929-6934.

[5] 藍雪銘, 劉志彬, 倪莉. 中國食品學報, 2014, 14(2): 201-207.

[6] Chen Y L, Duan J, Jiang Y M, et al. Food Rev Int, 2010. 27(1): 1-15.

Simultaneous determination of six catechins in Oolong by HPLC.

Wei Jie, Zhou Luwei, He Jinlian, Xie Jing

*(SchoolofPharmacy,ChegnduMedicalCollege,Chengdu610083,China)

HPLC separation was performed on a Shimadzu Wonda Cract ODS-2 analytical column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). with a flow rate of 1.0 mL·min-1. while the column temerature was 35 ℃. The mobile phase consisted of water containing 0.5% acitic acid (A) and acetonitrile (B) with a linear gradient elution of 10%-30% B for 40 min. The detection wavelength was 280 nm. The contents of EGC, C, EC, EGCG, GCG and ECG were 19.5-85.3 mg/g, 152.9-376.5 mg/g, 4.7-19.2 mg/g, 39.4-181.9 mg/g, 10.0-74.3 mg/g and 15.4-64.2 mg/g, respectively.

Oolong; catechins; HPLC

四川省2015大學生創新訓練項目(No. 201513705078)，四川省教育廳科研計劃(No. 16ZA0299)

韋杰，男，1994年出生，本科生。

謝靜，女，1979年出生，博士，講師，主要從事天然產物活性成分研究，Email: aggie-xj@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.06.012

2016-05-15